The Effect of Glucopyranosyldiacylglycerol from Padina arborescens on the Prevention of Hair-Loss

부챗말 Glucopyranosyldiacylglycerol의 탈모방지 효능

Abstract

This study was conducted to evaluate the effects of Padina arborescens and 1-O-myristoyl-2-O-oleoyl-3-O-(α-D-glucopyranosyl)-glycerol(MOGG), its active component, on the prevention of hair loss. The P. arborescens extract and MOGG inhibited the activity of 5α-reductase, which converts testosterone to dihydrotestosterone(DHT), a main cause of androgenetic alopecia. When immortalized rat vibrissa dermal papilla cells were treated with MOGG, the proliferation of dermal papilla cells significantly increased. In addition, we found that the P. arborescens extract and MOGG could open the K_ATP channel, which may contribute to increase hair growth. Furthermore, MOGG promoted PGE₂ production in HaCaT cells. The results suggest that MOGG from the P. arborescens extract has the potential to treat alopecia via 5α-reductase inhibition, the proliferation of dermal papilla, the opening of the K_ATP channel and/or increase of PGE₂ production.

탈모는 신체 또는 머리부위의 모발이 가늘어지며 감소하는 증상으로, 남성과 여성 모두에서 발생하며, 모낭의 축소화 및 성장기 모낭의 감소 등의 특징을 수반한다.^1,2) 지금까지 밝혀진 탈모 요인으로는 모발 주기 조절과 관련된 모유세포의 증식억제 또는 기능저하,³⁾ 남성호르몬의 작용에 의한 모발주기의 비정상화,⁴⁾ 두피로의 혈류량 저하로 인한 모발주기의 비정상적 변화,⁵⁾ 항암제,^6,7) 정신적 스트레스, 물리적 자극, 및 환경오염 등이 다양하게 거론되고 있다.^7,8)

탈모 치료제로는 현재까지 finasteride 및 minoxidil 두 약물만이 미국식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)의 승인을 받아 사용되고 있다. Finasteride(Propecia® )와 minoxidil(Rogain^®)은 각각 전립선 비대증 및 고혈압 치료를 위해 개발되었으나, 두 약물 모두 모발성장을 촉진하는 효능을 밝혀져 탈모방지제로 이용되고 있다.^9,10) Finasteride는 type II 5\(\alpha\)-reductase의 활성을 억제하여 테스토스테론(testosterone; T)의 dihydrotestosterone(DHT)로의 전환을 저해함으로써 안드로겐성 탈모를 개선함이 알려져있다.⁹⁾ Minoxidil은 모낭내 중배엽유래 세포인 모유두세포의 apoptosis를 억제하여 모유두세포의 증식을 촉진하며,¹¹⁾ ATP-sensitive potassium channels(KATP 채널) 개방효과^12,13) 등이 탈모방지 효과를 유도하는 것으로 여겨지고 있다. 모발의 성장 조절에 prostaglandin(PG)이 작용함이 알려지고 있다. PG 생성에 관여하는 효소들뿐만 아니라 PG 수용체들이 모낭내에서 발현됨이 보고되었다.^14,15) PGD₂ 는 모발주중 성장기에서 퇴행기로의 이행에 관여하며,¹⁶⁾ PGE₂ 및 PGF_2\(\alpha\)는 모발의 성장을 촉진한다.¹⁷⁾ 다른 한편, 원형탈모는 흔한 자가면역질환의 하나로,¹⁸⁾ 정상인에 비해 type 1 helper(Th1), Th2 및 IL-23 싸이토카인이 유의하게 증가된다.^19,20) 특히, 원형탈모 환자에서 염증성 싸이토카인 중 하나인 TNF-\(\alpha\)의 serum level이 증가됨이 밝혀져,²¹⁾ TNF-\(\alpha\)에 의한 NF- κB와 MAPK 신호전달경로의 활성화가 원형탈모의 진행에 작용하는 것으로 여겨지고 있다.

탈모 기전에 관여하는 많은 조절 인자들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 성장기, 퇴행기, 휴지기의 모발주기 조절에 관련된 인자들(fibroblast growth factor-7, Sonic hedgehog 및 transforming growth factor β)과 그들의 수용체에 의한 신호전달에 의하여 육모효과가 조절됨이 계속적으로 보고되고 있다.²²⁾

연구에서는 우리나라 제주 연안에 서식하는 갈조류인 부챗말 및 부챗말에서 분리된 단일물질인 1–O–myristoyl–2–O–oleoyl–3–O–(\(\alpha\)–D–glucopyranosyl)–glycerol의 탈모방효능을 조사하여 이들을 탈모방지제 및 탈모치료제로 이용할 수 있는 근거를 마련하고자 하였다.

재료 및 방법

부챗말 추출물의 제조

실험재료인 부챗말(Padina arborescens)은 2011년 제주도 동부 지역의 성산포 해안에서 채집하였으며, 제주대학교 해양과학대학의 이기완 교수가 감별하였다. 채집한 부챗말을 물로 여러 번 씻어 이물질을 제거한 후, -70^oC에서 동결 후에 건조하여 50메쉬 이하의 크기로 분말화하였다. 부챗말 분말 300 g에 80% 메탄올을 5 L 첨가한 후, 35^oC에서 24시간 동안 추출하였으며, 15분간 원심분리하여 잔사를 제거한 후, 여과하여 부챗말의 80% 메탄올 추출물액을 얻었다. 잔사에 다시 80% 메탄올을 첨가하여 3회 반복 추출하여, 부챗말의 80% 메탄올 추출물액을 수득하였다. 수득한 부챗말의 80% 메탄올 추출물액을 감압 농축하여 부챗말 추출물로 사용하였다.

1-O-myristoyl-2-O-oleoyl-3-O-(\(\alpha\)-D-glucopyranosyl)– glycerol의 분리정제

부챗말 추출물에 증류수를 넣어 현탁시킨 후에 n-hexane, chloroform 및 ethyl acetate로 계통분획하여, hexane 분획물 2.1 g, chloroform 분획물 4.1 g, ethyl acetate 분획물 0.7 g을 수득하였다. Chloroform 분획물에 대해 silicagel column chromatography(chloroform:methanol= 10:1 → 0:1)를 실시하여 얻은 소분획 중 12번째 분획물인 C- 12를 Sephadex LH-20 column chromatography하였으며, 얻은 소분획 중 5번째 분획물인 C-12-5를 ODS column chromatography (H₂O:methanol = 50:50 → 0:100)를 실시하여 화합물 1(27.9 mg)을 분리하였다. 분리한 화합물 1의 구조를 ¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) 및 ¹³C-NMR(100 MHz, DMSO-d₆)로 분석하였다. 화합물 1의 구조는 1–O–myristoyl–2–O– oleoyl–3–O–(\(\alpha\)–D–glucopyranosyl)–glycerol(MOGG)로 유추하였으며, 문헌23)과 비교하여 MOGG로 동정하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Structure of 1–O–myristoyl–2–O–oleoyl–3–O–(\(\alpha\)–D–glucopyranosyl)–glycerol (MOGG) from Padina arborescens

1-O-myristoyl-2-O-oleoyl-3-O-(\(\alpha\)-D-glucopyranosyl)–glycerol (1; MOGG)23): ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ_H: 5.41 (1H, d, J=3.7 Hz, H-10''), 5.31 (1H, t, J=4.6 Hz, H-9''), 5.12 (1H, m, H-2), 4.57 (1H, d, J=3.7 Hz, H-1'''), 4.34 (1H, d, J=11.9 Hz, H-1), 4.13 (1H, dd, J=7.3, 11.9Hz, H-1), 3.89 (1H, dd, J=6.0, 10.5 Hz, H-3), 3.77 (1H, m, H-5'''), 3.39 (1H, dd, J=5.5, 10.5 Hz, H-3), 3.34 (1H, m, H-3'''), 3.19 (1H, m, H-2'''), 2.90 (2H, m, H-4''', 6'''), 2.53 (1H, m, H-6'''), 2.28 (4H, m, H-2', 2''), 1.98 (2H, m, H-8'', 11''), 1.49 (4H, m, H-3', 3''), 1.19 – 1.30 (42H, H-4'– 13', 4'' – 8'', 11'' – 17''), 0.85 (6H, t, J=6.4 Hz, H- 14', 18''); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ_C: 172.5 (C-1''), 172.4 (C-1'), 129.6 (C-10''), 129.6 (C-9''), 98.3 (C-1'''), 74.3 (C-4'''), 72.9 (C-3'''), 71.6 (C-2'''), 69.7 (C-2), 68.6(C-5'''), 64.6 (C-3), 62.6 (C-1), 54.6 (C-6'''), 33.6 (C-2''), 33.4 (C-2'), 31.3 (C-12', 16''), 28.5 – 29.1 (C-4' – 11', 4''– 7'', 12'' – 15''), 26.6 (C-11''), 26.6 (C-8''), 24.5 (C-3', 3''), 22.1 (C-13', 17''), 14.0 (C-14', 18'').

5\(\alpha\)-Reductase Assay - 5\(\alpha\)-Reductase 활성은 rat prostate 5\(\alpha\)-reductase를 이용하여 [³H]testosterone(T)이 [³H]dihydrotestosterone(DHT)로 전환되는 양으로 평가하였다.²⁴⁾ 7~8주령 된 Wistar rat 수컷을 이산화탄소 가스를 사용하여 희생시킨 후에 바로 전립선을 적출하고, 곧바로 액체질소에 넣어서 보관하였다. 전립선을 4^oC의 homogenizer buffer [20 mM potassium phosphate(pH6.5), 0.32 M sucrose, 1 mM dithiothreitol(DTT), 0.2 mM phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF), 25 μg/mL aprotinin, 25 μg/mL leupeptin]를 넣은glass homogenizer에 넣고 뿌옇게 될 때까지 분쇄하였다. 원심분리(100,000 g, 60분, 4^oC) 후 pellet(nuclear, mitochondria, microsomes)을 얻은 후에 pellet에 homogenizer buffer를 넣어서 현탁하여 crude enzyme으로 사용하였다. 5\(\alpha\)-Reductase assay는 다음과 같이 수행하였다. Microtube에 crude enzyme과 시료 및 reaction buffer[40 mM potassium phosphate(pH6.6), 200 μM NADPH, 1 mM DTT, 120 nCi[1,2,6,7-³H]T)를 넣어 최종 반응액을 500 µL로 맞춘 후, 37^oC에서 60분간 반응시켰다. 1 mL의 ethyl acetate로 추출하고 완전히 건조한 다음, 50 µL의 ethyl acetate를 넣고, TLC plate에 spotting하고 전개용매(50% cyclohexane, 50% ethyl acetate) 하에서 전개하였다. UV spectrometer로 254 nm에서 T을 확인하고 10% 황산을 뿌려서 DHT를 확인하였다. T와 DHT 부위를 가위로 오려내서 각각의 scintilation vial에 넣고 cocktail 10 mL을 넣어 β- counter로 측정하였다. 양성 대조군으로 사용한 finasteride의 IC50값은 human 또는 rat 유래의 5\(\alpha\)-reductase enzyme에 따라 2~11 nM로 상이하며, 본 연구에서는 2 nM 농도로 finasteride를 처리하였다.²⁴⁾ 5\(\alpha\)-Reductase 활성에 의한 testosterone의 전환율을 DHT/(T+DHT)의 비로 계산하였다.

세포 배양

흰쥐 수염에서 분리된 모낭 유두 세포를 불멸화한 세포(Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell)²⁵⁾를 100 units/mL penicillin-100 μg/mL streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone Inc, USA) 배지를 사용하여 37^oC, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3 일에 한 번씩 계대배양 하였다. 불멸화된 인간 각질세포인 HaCaT 세포는 100 units/mL penicillin-100 μg/mL streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone Inc, UT, USA) 배지를 사용하여 37^oC, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3 일한 번씩 계대배양하였다. Mouse embryonic NIH3T3 fibroblasts는 ATCC(Rockville, MD, USA)에서 구매하였으며, 세포는 100 units/mL penicillin-100 μg/mL streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated bovine calf serum(BCS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM(ATCC, MD, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3 일에 한 번씩 계대배양 하였다.

MTT Assay

모낭 유두세포 및 NIH3T3 fibroblasts의 증식은 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 이용하여 측정하였다.²⁶⁾ 모낭 유두세포의 증식 측정을 위한 시료는 다음과 같이 처리하였다. 모낭 유두세포(1.0×10⁴ cells/mL)를 1% FBS를 포함한 DMEM 배지에 혼탁하여 96 well plate에 넣고 24시간 배양 후 시료를 처리하였다. 양성 대조군인 minoxidil(Sigma, MO, USA)는 10 µM의 농도로 처리하였다. NIH3T3 fibroblasts의 증식 측정을 위한 시료는 다음과 같이 처리하였다. NIH3T3 fibroblasts(1.0×10⁴ cells/mL)를 10% 또는 2% BCS를 포함한 DMEM 배지에 혼탁하여 96 well plate에 넣고 24시간 배양 후에 시료를 처리하였다. 양성 대조군으로 minoxidil을 75 μM의 농도로 처리하였다. 4일 동안 배양한 후 50 µL의 MTT(Sigma, MO, USA)을 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. 상층액은 제거하고 DMSO 200 µL을 가하여 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Amersham Pharmacia Biotech, NY, USA)를 사용하 여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식정도를 조사하였다.

각질세포에서의 PGE₂생성

HaCaT keratinocyte를 RPMI 배지를 이용하여 2×10⁵ cells/mL로 조절한 후 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전배양하였다. 배지를 제거하고 배지에 녹인 시료를 농도별로 처리하여 배양하였다. 상등액을 수거하여 상등액에 포함된 PGE₂의 양을 human PGE₂ enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit에 따라 반응을 시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Minoxidil을 양성 대조군으로 사용하여 활성을 비교하였다.

Western Blot Analysis

HaCaT 각질세포(2×10⁵ cells/mL)를 10% FBS 포함하는 RPMI 배지로 24 시간 동안 배양 후, 세포를 FBS-free RPMI 배지에서 24 시간 배양하였다. 부챗말 성분인 MOGG(12.5, 25 및 50 μg/mL)를 2 시간 전처리 후 TNF-\(\alpha\)(50 ng/mL)을 15 분 동안 처리하여 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후 120 μL의 lysis buffer[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO₃, 10 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 25 μg/mL aprotinin, 25 μg/mL leupeptin and 1% NP-40]를 첨가한 다음, 4°C에서 30 분 동안 lysis 시켰다. Cell lysate는 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었고 실험에 사용전까지 -20°C에 보관하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin를 표준물질로 사용하여 Bradford method에 의하여 정량하였다. ²⁷⁾ 20 μg의 lysate를 8-12% Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 변성 분리한 다음 polyvinylidene fluoride(PVDF) membranes(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 200 mA에서 2 시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% nonfat dried milk가 함유된 Tween-20-TBS(TBST)(50 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액에서 2 시간 동안 실시하였다. Membrane은 p(S536)-NF-κB(1:1000), IκB-\(\alpha\)(1:1000), pERK(1:1000), ERK(1:1000), p-JNK(1:1000), JNK(1:1000), p-p38(1:1000), p38(1:1000) 및 β-actin(1:5000)에 대한 primary antibody로 4°C에서 overnight 결합시켰다. Secondary antibody는 Horse Radish Peroxidase가 결합된 anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG를 1:5000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 반응을 진행하였다. 그 다음 TBST로 membane을 3회 세척한 후, ECL 기질(Intron, Seoul, Korea)로 1분 동안 반응시킨 다음 X-ray film(AGFA, Mortsel, Belgium)에 감광하였다.

통계분석

모든 측정결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검정은 unpaired student’s t-test로 검정하였으며, p-value가 0.05이하일 경우 유의성을 인정하였다. 통계처리는 Sigma Stat software(Jandel Scientific Software, USA)를 사용하였다.

결과 및 고찰

본 연구에서는 부챗말 및 그 성분인 MOGG의 탈모방지 효능 및 그 작용기전을 조사하였다. 본 연구의 부챗말의 활성성분들을 분리하는 과정에서 MOGG가 분리된 분획물에서 MOGG 이외의 2개의 물질을 분리하여 구조를 동정하기 위한 분석을 시도하였으나, 순도가 낮아 정확한 구조를 예측할 수 없었다. Glucopyranosyldiacylglycerol인 MOGG는 부챗말과 같은 갈조류의 하나인 참도박(Sargassum fulvellum)에서 분리 동정되었으며, 섬유소용해 활성을 나타냄이 보고된 바 있다.²³⁾ 본 연구에서는 처음으로 MOGG의 탈모방지 효능 및 그 작용기전을 규명하였다.

5\(\alpha\)-Reductase는 테스토스테론을 안드로겐 수용체에 결합력이 강한 DHT로의 전환에 관여하며, 이러한 DHT는 남성에서 가장 일반적인 발생하는 탈모의 유형인 안드로겐성 탈모의 주요 원인이다.^28,29) 특히, type II 5\(\alpha\)-reductase를 억제하는 것으로 알려진 finasteride는 안드로겐성 탈모 환자의 증상 개선에 기여한다.²⁸⁾ 또한, 안드로겐성 탈모 환자에게 type I과 II 양쪽 모두를 억제하는 dutasteride를 처리한 경우 두피 및 혈청 내 DHT 가 감소되며 모발수가 증가됨이 알려져 있으며, 비교 연구 결과 dutasteride는 finasteride 보다 개선된 효능을 나타낸다고 보고하였다.³⁰⁾ 실제로 5-reductase 억제 효능은 탈모방지 효능을 지닌 소재 연구에 있어서 주요한 타겟으로 알려져 있다.^31,32) 생후 7~8 주령의 SD rat 전립선 추출물을 사용하여 부챗말 추출물 및 MOGG의 5\(\alpha\)-reductase 활성 억제 효과를 조사하였다. 부챗말 추출물은 0.1, 1 및 10 μg/mL 농도에서 각각 40.3±6.8%(P<0.001), 29.5±8.1%(P<0.01) 및 14.8±1.8%(P<0.01) 정도 5\(\alpha\)-reductase 활성을 억제하였다(Fig. 2-A). 또한 부챗말에서 분리한 MOGG를 0.01, 0.1, 1 및 10 μM의 농도로 처리하였을 때, 21.3~28.3%(P<0.05) 정도로 5\(\alpha\)-reductase 활성을 억제하였다(Fig. 2-B). 0.01~10 μM의 농도 사이의 5\(\alpha\)-reductase 억제 활성의 유의성을 비교한 결과 5\(\alpha\)-reductase 활성 억제에 대한 각 농도 간의 차이를 확인할 수 없었다. 이러한 5\(\alpha\)-reductase 활성 억제 효과는 양성대조 물질로 사용한 finasteride의 억제 효과(84.5~99.5%)보다는 다소 낮은 것이나, 부챗말 추출물 및 부챗말에서 분리된 단일물질인 MOGG는 finasteride와 같은 5\(\alpha\)-reductase 활성 억제제로 작용하여 안드로젠성 탈모에 활용될 수 있음을 보여준다.

Fig. 2. Inhibition effects of P. arborescens extract and MOGG on rat prostatic 5\(\alpha\)-reductase activity. 5-Reductase activity was measured by liquid scintillation counting using [1,2,6,7-³H] testosterone. The reaction mixtures were incubated with the indicated concentrations of P. arborescens extract, MOGG or finasteride in the presence of crude extract of rat prostate. The conversion rate of testosterone (T) to dihydrotestosterone (DHT) was calculated by the equation: [DHT/(T + DHT)] X 100. The inhibition rate of 5-reductase activity (%) was estimated as a percentage of the reduction in conversion rate compared with the control. The inhibition rate of the control group was considered 0% (not shown). Data are presented as the mean ± SD. Finasteride was used as reference material to evaluate the inhibition of 5-reductase activity. *p<0.05, **p< 0.01, ***p<0.001 compared with the control.

모낭 유두세포는 모낭의 기저에 위치하는 중배엽 유래 세포로써, 상피세포로 이루어진 모기질 세포(matrix cells)등과의 상호작용을 통해 모발의 형성 및 성장에 중요한 요소로 작용한다고 알려져 있다.^33,34) 부챗말 추출물 및 부챗말에서 분리된 단일물질인 MOGG가 모낭주기 조절에 중요한 세포로 인식되고 있는 모낭 유두세포의 증식 효과가 있는지 조사하였다. 부챗말 추출물을 0.1, 1 및 10 μg/mL 농도로 처리하였을 때, 대조군(100%)에 비하여 각각 97.3±9.1%, 85.1±5.2% 및 81.7±8.3%의 증식률을 나타내어 모낭 유두세포의 증식에 대한 유의성 있는 차이를 확인하지 못했다(Fig. 3). 그러나, 부챗말에서 분리한 MOGG를 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM의 농도로 처리하였을 때, MOGG는 103.6±1.9%, 108.1±3.2%(P<0.01), 102.5±5.2%, 93.5±9.0% 및 98.0±9.3%의 증식률을 나타내었다(Fig. 3). MOGG 0.01 μM를 처리하였을 때, 대조군에 비하여 모낭 유두세포의 성장유의성 있게 증가되었으며, 양성대조군인 minoxidil (10 μM)은 115.2±9.7%(P<0.05)의 증식 효과를 나타내었다(Fig. 3).

Fig. 3. The effects of P. arborescens extract and MOGG on the proliferation of dermal papilla cells. Rat dermal papilla cells (1.0×10⁴ cells/mL) were plated in 96 well plates. Dermal papilla cells were stimulated with various concentrations of P. arborescens or MOGG, as indicated. Stimulation with minoxidil served as a positive control. Cell proliferation was measured using a MTT assay for 4 days. All experiments were performed in triplicate. Data are presented as the mean ± the S.D. *P<0.05 compared with the control.

Minoxidil의 육모효능이 모낭 유두세포에 있는 ATPsensitive potassium channels(KATP 채널)의 opening에 기인한다고 알려져 있다.¹²⁾ KATP 채널의 opener로 작용하는 물질은 NIH3T3 fibroblast cells에서 mitogenic 효능을 나타내어 fibroblast의 성장증식이 촉진됨이 알려져 있으며, 이와 같효능은 KATP 채널 차단제인tolbutamide 및 glibenclamide 등에 의하여 차단된다.³⁵⁾ 부챗말 추출물 및 부챗말에서 분리된 MOGG가 minoxidil처럼 KATP 채널 개방효과를 나타내는지 NIH3T3 fibroblast 증식 효능을 조사하였다. 부챗말 추출물을 0.01, 0.1 및 1 μg/mL 농도로 처리하였을 때, 108.7±7.7%(P<0.05), 114.0±3.9%(P<0.05) 및 101.1±3.2%의 증식률을 나타내었다(Fig. 4-A). 또한 부챗말에서 분리된 MOGG를 0.01, 0.1 및 1 μM의 농도로 처리하였을 때, 109.8±3.7%(P<0.05), 112.6±4.2%(P<0.01), 및 101.2±3.5%의 증식률을 나타내었다(Fig. 4-B). 0.01 및 0.1 μg/mL의 부챗말 추출물, 0.01 및 0.1 μM의 MOGG를 처리하였을 때, 대조군에 비하여 NIH3T3 fibroblast 성장이 유의성 있게 증가되어 KATP 채널 개방효과를 기대할 수 있다(Fig. 4). 이와 같은 부챗말 추출물 및 부챗말에서 분리된 단일물질인 MOGG의 NIH3T3 fibroblast 증식효과는 양성대조 물질로 사용한 75 μM minoxidil의 131.8%(P<0.001) 증식률 증가효과보다 다소 낮았다(Fig. 4).

Fig. 4. The effects of P. arborescens extract and MOGG on the proliferation of NIH3T3 fibroblasts. Mouse embryonic NIH3T3 fibroblasts (1.0×10⁴ cells/mL) were plated in 96 well plates. NIH3T3 fibroblasts were treated with various concentrations of P. arborescens or MOGG, as indicated. Stimulation with minoxidil served as a positive control. Cell proliferation was measured using a MTT assay for 4 days. All experiments were performed in triplicate. Data are presented as the mean ± the S.D. *P<0.05, **P<0.01, **P<0.001 compared with the control.

Prostaglandin E₂(PGE₂)는 모발 성장에 있어서 중요한 분자로 작용하며, PGE₂ analogue인 viprostol은 인간의 모발 성장을 증가시킨다고 알려져 있다. ³⁶⁾부챗말에서 분리된 단일 물질인 MOGG에 의한 PGE₂ 생성 효과를 조사하였다. 우선, MOGG에 의한 세포 생존률의 변화를 확인한 결과, MOGG를 12.5, 25 및 50 μg/mL로 처리하였을 때, HaCaT 각질세포의 생존율에는 유의한 변화가 관찰되지 않았다(Fig 5-A). 같은 조건에서 PGE₂ 생성 효과를 조사하였을 때, MOGG(50 μg/mL)이 PGE₂ 생성을 증가시켰으며(P<0.05), 양성대조군으로는 100 μM minoxidil을 사용하였다(Fig. 5- B).

Fig. 5. The effect of MOGG on the PGE₂ production in HaCaT human keratinocytes. The cells treated with MOGG (12.5, 25, 50 µg/mL) for 24 h. Cell viability was confirmed by WST assay. (B) The cells were treated with MXD (Minoxidil, 100 µM) or MOGG (12.5, 25, 50 µg/mL) for 24 h and then the PGE₂ production was determined from the cell culture supernatants using ELISA. Bars and Error bars indicate the mean ± S.D. *P<0.05 compared with the control.

염증성 싸이토카인인 TNF-\(\alpha\)가 원형탈모의 진행에 중요한 역할을 하며,²¹⁾ TNF-\(\alpha\)는 세포에서 NF- κB와 MAPK 신호전달경로의 활성화를 유도함이 알려져 있다.³⁷⁾ 피부 각질 세포인 HaCaT 세포에 TNF-\(\alpha\)를 처리하여 NF- κB와 MAPK pathway의 활성화를 유도하여, 이에 대한 부챗말에서 분리된 단일물질인 MOGG의 효과를 조사하였다. MOGG를 12.5, 25 및 50 μg/mL로 전처리하였을 때, TNF-\(\alpha\)로 유도되는 IκB-\(\alpha\)의 분해 또는 NF- κB의 인산화에 대한 억제효과가 미약하였으며, MAPK 경로(ERK, JNK, p38)의 인산화에도 억제효과를 보이지 않았다(Fig. 6). 부챗말에서 분리된 단일물질인 MOGG는 HaCaT 각질 피부세포에서 TNF-\(\alpha\)의 신호전달경로에 활성을 나타내지 않았으며, MOGG가 TNF-\(\alpha\)로 유도되는 원형탈모에는 활용될 수 없음을 보여준다.

Fig. 6. The effect of MOGG on the TNF-\(\alpha\) signaling pathway in HaCaT human keratinocytes. The cells were pretreated with MOGG (12.5, 25, 50 µg/mL) for 2 h prior to incubation with TNF-\(\alpha\) (50 ng/mL) for 15 min. The whole cell lysate from HaCaT cells were subjected to immunoblotting with indicated antibodies.

결론

연구의 결과는 부챗말 추출물 및 부챗말에서 분리된 단일물질인 MOGG가 탈모방지 효능에서 중요한 5\(\alpha\)-reductase 억제 활성, KATP 채널 개방효과 및 모낭 유두세포성장 증식을 촉진 효과를 통해 모낭의 성장기를 활성화 할 수 있음을 알 수 있다. 이는 부챗말 추출물 및 부챗말에분리된 단일물질인 MOGG가 탈모치료 및 예방제로 이용될 수 있는 근거를 제시하는 것이다