Cancer Cell Growth Inhibition of Lanostane-type Triterpenoids Isolated from Ganoderma gibbosum

칠황버섯으로부터 분리한 Lanostane-type Triterpenoid의 암세포성장 억제효과

Abstract

The CHCl₃ fraction of the MeOH extract of Ganoderma gibbosum (Ganodermataceae) exhibited cytotoxic activity on five cancer cell lines (MDA-MB-231, SK-hep1, A549, HCT116, and SNU638). Six highly oxygenated lanostane-type triterpenoids (lanostanoids) were isolated by column chromatography to test cytotoxicity on cancer cells. The five known lanostanoids were identified as gibbosic acids A, B, D, G, and H by comparison of molecular ion peaks with the literature data. The structure of a new lanostanoid, gibbosic acids I, was identified to be 3β,8β,15β,20S-tetrahydroxy-7,12,23-trioxolanost-9(11)-en-26-oic acid on the basis of NMR and MS spectroscopy. The three lanostanoids of gibbosic acids A, H, and I of the six isolates significantly suppressed the growth of cancer cells. In particular, the IC₅₀ of gibbosic acid H was prominently low ranging from 2.64-6.56 μM.

칠황버섯(Ganoderma gibbosum, Ganodermataceae = Polyporaceae)은 썩거나 죽은 낙엽수의 그루터기에서 기생하여 자라는 버섯의 일종이다. 최근 한국에서는 칠황버섯을 옻나무(Rhus verniciflua, Anacardiaceae)를 이용하여 재배하는데 성공하여 암 치료에 효과가 있다고 알려짐에 따라 민간에서 각광받고 있다. 저자들은 칠황버섯을 이용하여 백혈병을 치유했다는 사례에 주목하여 본 연구를 수행하게 됐다. 이 버섯은 그 외에도 소화기능증진, 면역강화, 노화방지효과가 있다고 하며, 변비 및 고혈압에도 효과가 있다고 한다. ¹⁾

암 치료에 가장 효과가 있는 버섯으로는 상황버섯(Phellinus linteus)이 유명하다. ²⁾ 그리고 Ganoderma속에 속하는 버섯류인 영지버섯(Ganoderma lucidum)도 암치료 이외에도 여러 가지 효능을 가지는 것으로 알려져 있다. ³⁾ 최근에는 한국의 민간에서 칠황버섯을 항암목적으로 사용하고 있으므로 그 활성성분을 찾기 위한 노력으로 본 연구를 수행하였다.

칠황버섯으로부터 메탄올 추출물을 얻은 후 분획물을 제조하여 그 추출물과 분획물에 대한 세포독성 실험을 수행한 결과 CHCl₃ 분획에서 높은 활성이 나타났으므로 이 분획을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 물질 분리를 활성 성분을 탐색하는 실험을 수행하였다. 암세포성장 저해활성은 SRB assay법으로 5종의 암세포주인 MDA-MB-231(breast), SK-hep1(liver), A549(lung), HCT116(colon) 및 SNU638 (stomach)를 이용하여 측정하였다.

재료 및 방법

기기 및 시약

Mass spectrum의 측정은 Agilent technologies사의 Single quadrupole LCMS spectrometer를 이용하여 socondary ion mass spectrometry(SIMS) 법으로 측정하였다. ¹H-, ¹³C-nuclear magnetic resonance(NMR)은 Bruker AM-600 spectrometer(Bruker, Rheinstetten, Germany)을 사용하였고 내부표준물질로 TMS(tetramethylsilane)으로 하여 측정하였다. 화합물 분리를 위한 컬럼으로 Yamazen사의 prepacked column(30 µm, Japan)을 사용하였다.

식물재료

경상북도 문경시 산양면 소재의 ㈜ 원칠황(대표: 이원용)에서 재배한 칠황버섯(G. gibbosum)의 자실체를 공급받았다. 이 버섯은 상지대 원예조경학과 임상철 교수에 의해 칠황버섯으로 동정되었다. 이를 건조한 후 세절하여 추출을 위한 재료로 사용하였다. 또 이 칠황버섯의 표본 (natchem-# 127)은 상지대학교 제약공학과 천연물화학 실험실에 보관 중이다.

추출과 분획

칠황버섯 840 g을 플라스크에 넣고 5L의 용매로 각 5시간씩 환류 하에 세 번 반복하여 추출하였다. 추출액을 여과한 후 rotatory evaporator를 이용하여 농축한 후 최종적으로 진공 오븐으로 건조하여 MeOH 추출물 92.0 g을 얻었다.

이를 분획하기 위하여 1.0 L의 H₂O에 현탁시킨 후 먼저 1.0 L hexane으로 분획하는 과정을 3회 반복하였다. Hexane 가용부를 감압농축한 후 진공오븐에서 건조하여 8.9 g을 얻었다. H₂O 분획을 더욱 1.0 L의 CHCl₃ 로 분획하는 과정을 3회 반복하여 CHCl₃ 가용부를 얻었다. CHCl₃ 가용부를 동일한 방법으로 건조하여 CHCl₃ 분획 28 g을 얻었다. 남은 H₂O 층에 대하여 EtOAc로 3회 분획하고 EtOAc 가용부를 건조하여 EtOAc 분획 6.8 g을 얻었다. 마지막으로 남은 수층에 대해 BuOH로 분획하였고, BuOH 가용부를 얻은 후 건조하여 BuOH 분획 13 g을 얻었다.

Lanostanoid의 분리

CHCl₃ 분획으로부터 화합물을 분리하기 위하여 silica gel column(30 μm, Φ 5 cm×20 cm, Yamazen, Japan)을 사용하였다 전개용매로 CHCl₃-MeOH-H₂O(8:1:1, lower phase) 용매를 사용하였고, 이 전개용매 0.9 L를 사용한 후 0.9 L의 CHCl₃-MeOH-H₂O(8:2:1, lower phase)로 변경하여 전개하였다. 약 50 mL씩 분취하면서 54개의 소분획(#1-54)을 얻어서 각각을 TLC로 체크하여 7개의 그룹으로 분류한 후 농축하여 GG-1(#9-12), GG-2(#23-30), GG-3(#42-44), GG-4(#46-47), GG-5(#50-51), GG-6(#52-54)를 얻었다.

GG-1는 sephadex LH-20 column에서 MeOH로 용출하여 정제하여 compound 1를 얻었다. GG-2와 GG-3, GG-4의 MeOH 용액 중 재결정하여 compound 2, compound 3, compound 4를 각각 얻었다. GG-7, GG-8에 대해서도 Sephadex LH-20 column에서 더욱 정제하여 compound 5, 6을 각각 얻었다. 각 화합물에 대한 신속한 동정을 위해 질량스펙트럼을 측정하였다.

Compound 1(gibbosic acid A): White powder, ESI-MSm/z 549.1 [M + Na]⁺.

Compound 2(gibbosic acid B): White powder, ESI-MSm/z 551.2 [M + Na]⁺.

Compound 3(gibbosic acid D): White powder, ESI-MSm/z 553.2 [M + Na]⁺.

Compound 4 (gibbosic acid E): White powder, ESI-MSm/z 567.2 [M + Na]⁺.

Compound 5(gibbosic acid I): White powder, ESI-MSm/z 571.2 [M + Na]⁺.

Compound 6(gibbosic acid H): White powder, ESI-MSm/z 569.2 [M + Na]⁺.

Compound 5의 NMR 측정

분자량에 근거하여 화합물 5의 화합물이 Pu 등이¹⁾ 발표한 lanostanoid 화합물 중에 없었으므로, 이 화합물의 구조를 결정하기 위하여 CDCl₃ 용매 중에서 ¹H-NMR spectrum과 ¹³C-NMR spectrum을 측정하였다.

Compound 5

White powder, ¹ H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 1.05-2.26 (3H × 8), 3.15 (1H, dd-like, H-3), 6.10 (1H, s); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ: 37.0 (C-1), 27.2 (C-2), 76.2 (C-3), 39.7 (C-4), 47.0 (C-5), 35.4 (C-6), 206.3 (C-7), 81.2 (C-8), 165.0 (C-9), 39.5 (C-10), 124.0 (C-11), 204.6 (C-12), 66.0 (C-13), 47.0 (C-14), 75.2 (C-15), 34.4 (C-16), 48.5 (C-17), 28.5 (C-18), 19.8 (C-19), 72.1 (C-20), 28.5 (C-21), 50.8 (C-22), 210.5 (C-23), 46.9 (C-24), 34.4 (C-25), 16.8 (C-26), 179.0 (C-27), 27.2 (C-28), 14.3 (C-28), 25.6 (C-30).

세포배양

인체 암세포인 폐암 세포(A549), 대장암 세포(HCT116), 유방암 세포(MDA-MB-231), 간암 세포(SK-HEP-1) 등 4종의 암세포주를 American Type Culture Collection(ATCC, VA, USA)로부터 제공받았고, 나머지 한종인 위암 세포주(SNU-638)는 Korean Cell Line Bank (KCLB)로부터 제공받아 사용하였다. 세포주들은 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS) and antibiotics-antimycotics(PSF; 100 units/mL penicillin G sodium, 100 ng/mL streptomycin, and 250 ng/mL amphotericin B)를 추가한 배지를 사용하여 배양하였다. 여기서 SK-HEP-1 세포주에 대해서만 DMEM 배지로 배양하였고, 나머지 4종 세포주는 A549, HCT116, SNU-638, MDA-MB-231에 대해서는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 각 세포들 5% CO₂ 를 함유한 습윤 공기 중에서 37ºC 온도로 유지하였다.

세포증식 실험

세포의 증식에 대한 시료의 억제효과는 5종의 세포주에 대해서 모두 sulforhodamine B(SRB) assay로 수행하였다. 여러 농도의 시료를 넣은 96-well plate에 세포를 접종하고 5% CO₂ 를 함유한 습윤 공기 중에서 37ºC에서 72시간 인큐베이션하였다. SRB assay에서 10% trichloroacetic acid로 고정하였다. 세포 단백질은 1% acetic acid solution를 포함하는 0.4% SRB로 염색한 후 10 mM Tris buffer(pH 10.0)에 녹였다. 흡광도는 515 nm 파장으로 측정하였다. 세포증식 백분율(%)은 cell proliferation(%) = 100 × [(A_treated–A_{zero day})/(A_control–A_{zero day})]의 계산식을 이용해서 얻었다. 여기서, A는 평균 흡광도를 말한다. IC₅₀치는 TableCurve 2D v5.01(Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)를 이용하여 비직선 회귀분석을 통하여 계산하였다. 그리고, 데이터는 3회 반복실험한 평균치를 기록하였다.

결과 및 고찰

저자들은 칠황버섯에서 항암활성을 나타내는 화합물을 찾기 위한 노력의 일환으로 본 연구를 수행하였다. 칠황버섯으로부터 얻은 MeOH 추출물과 이로부터 용매분획하여 얻은 hexane 분획, CHCl3 분획, EtOAc 분획, 그리고 BuOH분획을 얻어서 세포독성 실험을 수행하였다. 암세포주로서는 유방암 세포주(MDA-MB-231), 간암 세포주(SK-hep1), 폐암 세포주(A549), 대장암 세포주(HCT116), 그리고 위암 세포주(SNU638)를 사용하였다.

Table I에 나타내었듯이, MeOH 추출물과 EtOAc 분획 및 BuOH 분획에서는 50 μg/ml 이하에서는 효과가 나타나지 않으나 CHCl₃ 분획은 5종 암세포주에 대해 높은 세포독성을 나타내었다. CHCl₃ 분획은 MDA-MB-231 유방암 세포주에 대해 IC₅₀가 19.02 μg/ml로 확인되어 가장 높은 세포독성 효과를 나타냄을 알 수 있었다. Hexane 분획은 SKhep1과 SNU638 세포주에서 그 IC₅₀가 47.55 μg/ml, 47.59 μg/ml로 세포독성 효과를 나타내나 나머지 3종 세포주에 대해서는 50 μg/ml 이하에서 효과를 나타내지 않았다.

Table I. Cytotoxic activity (IC₅₀, μg/ml) of the MeOH extract of G. gibbosum and its fractions on five cancer cell growth in vitro

1) Cancer cell line: MDA-MB-231 (breast), SK-hep1 (liver), A549 (lung), HCT116 (colon), SNU638 (stomach).

2) This alue (unit: μM) represents the mean of three independent experiments.

이에 따라 CHCl₃ 분획에 암세포 증식을 억제하는 화합물이 존재할 것으로 예견되었으므로 silica gel column chromatography로 화합물 분리를 시도하였다. 그 결과 6종의 화합물이 분리되었다. 칠황버섯으로부터 highly oxygenated lanostane-type triterpenoid가 Pu 등에¹⁾ 의해 알려졌기 때문에 본 연구에서는 신속한 동정을 위해 SIMS법으로 mass spectrum을 얻어서 동정하고자 하였다. Mass spectrum에서 얻은 pseudomolecular ion([M + Na]⁺ )을 문헌치와 비교하여 각 화합물을 동정할 수 있었으므로 그 분자량은 Table II에 나타내었고, 그 구조는 Fig. 1에 나타내었다. 분리된 6종 화합물은 tetracyclic triterpenoid인 side chain을 갖는 lanostane-type triterpenoid로서 ketone group을 2–4개를 가지며, hydroxyl group를 1–4개를 가지고 있다. 그러나, 화합물 5는 Fig. 2에 나타낸 바와 같이 pseudomolecular ion이 m/z 571.2에서 나타나 미지의 lanostanoid이었다.

Fig. 1. Structure of lanostane-type triterpenoids (1 – 6) isolated from G. gibbosum.

Table II. Identification of gibbosic acids isolated from Ganoderma gibbosum by SIMS-MS

Fig. 2. Mass spectrum of compound 5.

그러므로 화합물 5는 Pu 등이 G. gibbosum에서 분리한 lanostanoid나 유사버섯인 Elfvingia applanata에서 밝혀진 elfvingic acids A – H의 8종 lanostanoid⁴⁾ 및 Ganoderma orbiforme에서 밝혀진 triterpenoid에도⁵⁾ 해당하지 않는 lanostanoid였다. 이들 lanostanoid들은 16-위치가 이중결합 혹은 단일결합의 양상으로 나타난다. 화합물 5는 pseudomolecular ion이 m/z 571.2로서 compound 6에 비해 분자량이 2amu만큼 더 크므로 16 위치가 수소화된 3β,8β,15β,20S-tetrahydroxy-7,12,23-trioxolanost-9(11)-en-26-oic acid (5)구조로 예상되었다. 그러므로 이 화합물의 구조를 확정하기 위하여 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR spectrum을 측정하였다. 그 결과, ¹H-NMR spectrum에서는 8개의 methyl기가 δ 1.05 –2.26에서 확인되며, α,β-unsaturated ketone 구조에 기인한 H-11의 피크가 singlet로 나타났을 뿐 아니라 H-3의 피크가 δ 3.15에서 나타났다. 또, ¹³C-NMR spectrum에서 나타난 피크들을 유사구조의 gibossic acid D(3)와 gibbosic acid H(6)와 비교하여 잘 assignment할 수 있었다. ^4,5) 4개의 수산기가 δC 76.2(C-3), 81.2(C-8), 75.2(C-15), 72.1(C-20)에서 확인되고, 이중결합의 탄소 피크가 165.0과 124.0에서 확인되며, 또 27-COOH가 179.0에서 나타났다. 그러므로, 이 화합물은 3β,8β,15β,20S-tetrahydroxy-7,12,23-trioxolanost-9(11)-en-26-oic acid (gibbosic acid I)구조를 가지는 lanostanoid임을 알 수 있었다. 이상과 같이 compound 1 – 6의 6종 lanostanoid 화합물을 G. gibbosum에서 분리하였으며 구조를 확인할 수 있었다.

이 6종 화합물에 대한 세포독성 실험 결과를 Table III에 나타내었다. 이 중 gibbosic acid A, gibbosic acid H, gibbosic acid I 화합물이 활성을 나타내었다. 특히 가장 강한 효과를 나타내었던 gibbosic acid H는 IC₅₀치가 2.64 –6.56 μM 수준의 효과를 나타내어 암세포주 성장에 대한 현저한 저해효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이 화합물의 암세포에 대한 효과는 간암 세포주인 Skhep1에 대한 활성이 가장 높아 그 IC₅₀가 2.64 μM로 확인되어 유망하다.

Table III. Cytotoxic activity (IC₅₀) of the six compounds on five cancer cell growth in vitro

3) Cancer cell line: MDA-MB-231 (breast), SK-hep1 (liver), A549 (lung), HCT116 (colon), SNU638 (stomach).

4) This alue (unit: μM) represents the mean of three independent experiments.

결론

칠황버섯 추출물과 그 분획물에 대한 암세포성장 저해효과에 관한 실험을 하여 lanostanoid를 함유하는 CHCl₃ 분획이 그 효과를 크게 나타내었다. 각종의 크로마토그래피의 방법을 이용하여 CHCl₃ 분획으로부터 6종의 gibbosic acid를 분리하고 SIMS법에 의해 질량스펙트럼을 측정하여 pseudomolecular ion으로부터 그 구조를 신속히 동정할 수 있었다. 이 중 gibbosic acid I는 그 NMR spectrum을 해석하여 3β,8β,15β,20S-tetrahydroxy-7,12,23-trioxolanost-9(11)-en-26-oic acid 구조로 나타났으며, 이 화합물은 아직 알려져 있지 않은 lanostanoid 화합물이었다. 6종 화합물 중 gibbosic acid A, H, I가 암세포 성장을 현저히 억제하는 효능을 보였으므로, 이들 화합물이 칠황버섯의 항암효과에 기여할 것으로 예상되었다. 특히, gibbosic acid H는 그 IC₅₀치가 2.64 – 6.56 μM 범위에서 나타나 항암효과 연구를 위한 소재로 유망하다.