LPS로 유도한 RAW 264.7 세포 및 귀부종 동물 모델에 대한 밀배아유의 항염증 효과

Anti-Inflammatory Effect of Wheat Germ Oil on Lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 Cells and Mouse Ear Edema

Abstract

밀배아유가 LPS로 자극된 대식세포에서 염증과 관련된 인자들에 미치는 영향을 살펴보기 위해, NO 및 전염증성 cytokine의 분비량과 iNOS 및 COX-2의 발현량, NF-κB p65와 MAPKs 활성화를 확인하였다. 또한 ICR 마우스를 이용하여 croton oil로 유도된 귀부종을 통해 귀두께 변화 및 귀조직을 관찰하였다. 그 결과, 밀배아유는 LPS로 인해 증가된 NO 및 전염증성 cytokine의 분비량을 감소시켰으며, 특히, IL-6와 TNF-α는 100 μg/ml 농도에서 90% 이상의 분비 억제효과를 나타내었다. LPS에 의해 증가된 iNOS와 COX-2의 발현은 100 μg/ml 농도로 밀배아유 처리시 발현 억제가 가장 크게 나타났으며, NF-κB p65의 발현도 밀배아유 농도가 증가함에 따라 발현 억제효과를 나타내었으며, 100 μg/ml 농도로 처리 시 억제 효과가 가장 컸다. 밀배아유는 MAPKs의 인산화를 억제시켰으며, 특히, ERK와 JNK의 인산화 억제가 농도 의존적으로 크게 효과를 나타내었다. 또한, 밀배아유는 croton oil로 유도된 귀부종에서 귀두께를 감소시켰으며, 경피와 진피의 두께 및 진피에 침윤된 비만세포의 수도 감소시킴을 확인하였다. 이상으로, 밀배아유는 NF-κB 및 MAPKs의 신호 경로 조절을 통한 염증성 매개 인자들의 발현 감소로 항염증 효과를 나타냄을 확인하여, 천연 항염증 소재로서 활용도가 가능함을 시사한다.

This study investigated the anti-inflammatory effects of wheat germ oil (WGO) on RAW 264.7 cells. It was shown that WGO had no cytotoxicity against the treated cells or negative effect on their proliferation. WGO suppressed nitric oxide (NO) secretion considerably and had inhibitory effects on the production of LPS-induced NO and pro-inflammatory cytokines (IL-6, TNF-α, and IL-1β). In particular, the IL-6 and TNF-α inhibition activities were over 90% at 100 μg/ml concentration of the oil. WGO also inhibited the LPS-induced expression of cyclooxygenase-2, inducible nitric oxide synthase, and nuclear factor-kappa B (NF-κB), and reduced the expression of phosphorylated ERK and JNK. Moreover, the croton-oil-induced edema in mouse ears was reduced by WGO, and no mortalities occurred in mice administered 5,000 mg/kg body weight of WGO over a 2-week observation period. In conclusion, these results provide evidence for the anti-inflammatory effect of WGO that likely occurs via modulation of NF-κB and the JNK/ERK MAPK signaling pathway.

서 론

염증 반응은 물리적, 화학적 자극이나 세균감염과 같은 외부자극에 대응하기 위한 생체조직에서 일어나는 방어반응으로써 손상된 조직을 수복하거나 재생하려는 기전을 의미한다[36]. 염증반응이 일어나면, 혈관 활성물질인 histamine, prostaglandins, leukotriene, hydroxyeicosatetraenoic acid등이 유리되어 혈관이 확장되고, 혈액투과성이 증대되어 백혈구가 조직으로 침투하게 된다[9, 34]. 이러한 염증반응이 과도하게 일어나면 만성염증을 유도하여 염증매개물질이 과도하게 분비되어 암, 동맥경화등과 같은 다양한 병리학적 기전에 관여하게 된다[4, 28]. 체내의 염증반응에 관여하는 세포중 하나인 대식세포는 이러한 염증반응에 중요한 역할을 하고 있다. 대식세포는 내독소인 lipopolysaccharide (LPS)의 자극으로 인하여 활성화되며 pro-inflammatory cytokine인 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), IL-6를 증가시킨다[14, 15]. 이러한 pro-inflammatory cytokine의 발현은 nuclear factor-kappa B (NF-κB)와 extracellular signal-regulated kinase (ERK), p38 kinase (p38), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK)와 같은 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)에 의해 조절된다[7]. 또한 체내의 염증과정에는 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)에 의하여 과량의 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PGE2) 등의 염증인자가 생성된다. NO는 아미노산인 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 합성되며, 활성화된 대식세포는 NO를 분비하여 상피세포의 DNA의 변이와 세포 사멸 및 괴사를 유도하여 암이나 동맥경화를 유도할 수 있다[32]. 따라서 대식세포 매개의 염증반응의 조절을 위하여 NO 생성 효소인 iNOS, prostaglandin 생합성의 단계효소인 COX-2와 염증성 cytokine들의 발현조절과 이들의 주요 신호전달 분자인 MAPKs와 NF-κB의 활성 조절은 염증반응을 조절하기 위한 핵심적인 요소로 인식되고 있다[21]. 현재 이들의 생성과 생성에 관여되는 효소의 발현을 조절할 수 있는 물질이 염증 질환 예방 및 치료제로서 주목을 받고 있으며, 특히 화학적인 약품이 아닌 천연물이나 한약 재료에 의한 염증 질환 치료제 및 보조제가 각광받고 있으며 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다[12].

밀배아는 소맥의 제분과정에서 얻어지는 부산물로 밀알의 2−3%을 함유하고 있으며, 발아하는 부위로서 지방이 상당히 함유되어 있다[13]. 현재 대부분의 밀배아는 주로 사료로만 이용되고 있어 활용도가 낮은 실정이다. 밀배아유에는 천연 항산화제인 비타민 E와 carotenoids 색소 등이 많이 함유되어 있고, tocopherol과 phenolic 류의 천연 기능성 물질들이 많이 함유되어 있다. 또한 밀배아유에는 불포화지방산 및 필수지방산의 함량이 높아 식품소재로서의 높은 가치를 지니며[16], 불포화지방산이 함유된 oil에서 항염증 효과가 있는 것으로 밝혀져 있으나[17, 31], 밀배아유의 항염증 활성에 대한 연구는 아직 보고되지 않았다.

따라서, 본 연구에서는 밀배아유의 염증성 질환에 대한 효과를 확인하기 위하여 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포 및 croton-oil로 유도된 귀부종 동물 모델에서 항염증 활성을 조사하여 밀배아유의 천연 항염증 소재로서 이용가능성을 알아보았다.

 

재료 및 방법

실험재료

본 실험에 사용한 밀배아유(Gooworl, Korea)는 4℃에서 저장하며 실험 전 상온에 방치 후 사용하였다. 사용한 밀배아유의 지방산 조성의 함량은 palmitic acid (C16) 9.47%, stearic acid (C18) 3.79%, oleic acid (C18:1) 27.16%, linoleic acid (C18:2) 52.3%, linolenic acid (C18:3) 3.6%이였다.

실험동물

생후 8주령의 수컷, ICR 마우스를 오리엔트바이오(Orient Co., Korea)로부터 구입하여 귀 부종 실험에 사용하였으며, 생후 10주령의 암컷, Balb/c 마우스는 단기 독성 평가 실험에 사용하였다. 마우스는 온도 20 ± 2℃, 습도 50 ± 10%, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실에서 1주일간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 부경대학교 동물윤리실험윤리위원회로부터 동물실험 승인을 받아 수행하였다(승인번호 2014-01).

세포배양

마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB40071)에서 분양받아 사용하였으며, DMEM (GIBCO, USA)에 10% inactivated fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 배지를 배양액으로 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 실험과정의 모든 세포는 80−90% 정도의 밀도로 자랐을 때 계대 배양하였고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.

세포독성측정

시료의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다. RAW 264.7 세포를 1 × 106 cells/ml 농도로 96-well plate에 분주하고 20시간 전 배양 후, 밀배아유(0.1, 1, 10, 50, 100 μg/ml)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 22시간 배양하였다. 배양 후, 5 mg/ml 농도의 MTT 시약을 첨가하여 2시간 재 배양하고 이를 4℃, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리(UNION 32R, Hanil Co., Korea)하여 상층액을 제거하였다. 그 후, 각 well에 DMSO를 첨가하고 이를 microplate reader (Model 550, Bio-Rad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 다음 식에 의해 계산하였다.

Proliferation index (%) = sample 흡광도/control 흡광도 × 100

Nitric oxide 생성량 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess 반응을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포는 DMEM 배지를 이용하여 2.5 × 105 cells/ml로 조절한 후 24-well plate에 접종하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 18시간 전 배양하였다. 배지를 교환 후, RAW 264.7 세포에 1 μg/ml LPS와 밀배아유(0.1, 1, 10, 50, 100 μg/ml)를 처리하여 20시간 재 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후, 동량의 griess 시약(1% sulfanilamide + 0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1：1)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.

염증관련 cytokine 분비량 측정

세포배양액 내의 TNF-α, IL-6, IL-1β cytokine의 분비량을 ELISA-kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, USA)를 이용하여 측정하였다. 먼저, ELISA microplate에 anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β mAb를 분주하여 하룻밤 동안 coating시켰다. 이를 0.05% Tween 20이 포함된 PBST로 세척한 후, 10% FBS 용액으로 blocking하였다. PBST로 세척한 뒤, 각 microplate에 배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 뒤 희석한 biotinylated anti-mouse TNF-α, IL-6 mAb와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. IL-1β의 경우, biotinylated anti-mouse IL-1β detection antibody 를 첨가하고 1시간 반응시킨 후, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30분 반응시켰다. 그 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD 용액을 첨가하여 암반응시키고 microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

iNOS, COX-2 및 NF-κB p65 발현량 측정

배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 후, iNOS 및 COX-2의 경우 cytosolic lysis buffer [50 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg/ml aprotinin, 1% Triton X-100, 0.1% NP-40]를 이용하였으며, NF-κB p65의 경우 nucleus lysis buffer (10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM dithiothreitol)를 첨가하여 30분간 4℃에서 lysis 시킨 후, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay kit (Pierce, USA)를 사용하여 정량하였으며, 30 μl의 lysate를 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (Bio-Rad)에 200 mA에서 1시간 동안 전사시킨 후, 5% skim milk가 포함된 TBSS (tris buffered saline; pH 7.5) 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking 하였다. iNOS, COX-2 및 NF-κB p65의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2 및 NF-κB p65를 사용하여 1:500으로 희석하고 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBSS로 3회 세정하였다. 2차 항체로 horseradish peroxidase가 결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 TBSS로 3회 세정하여 ECL 기질과 1−3분간 반응 후 각각의 단백질 밴드는 Gene tool (GeneGnome5, Syngene, UK)을 이용하여 가시화하였다.

MAPKs 측정

MAPKs의 발현에 미치는 밀배아유의 억제 효과를 알아보기 위해 RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1 × 106 cells/ml으로 18시간 전 배양 하고 LPS를 단독 또는 밀배아유(0.1, 1, 10, 50, 100 μg/ml)와 함께 처리하여 30분동안 본 배양 하였으며, 이후의 실험은 iNOS, COX-2 및 NF-κB p65와 동일한 방법으로 진행하였다. p-JNK, p-ERK 및 p-p38의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse p-JNK, p-ERK 및 p-p38을 이용하여 1:500으로 희석하여 사용하였다.

귀 부종 측정 및 조직관찰

밀배아유의 in vivo에서 항염증 효과를 확인하기 위하여, croton oil로 부종이 유도된 ICR 마우스 모델에서 귀 부종 억제 및 귀 조직 관찰을 진행하였다. 밀배아유를 10, 50 및 250 mg/kg body weight 농도로 200 μl씩 ICR 마우스에 경구 투여하였다. 한 시간 후 오른쪽 귀에 2.5% croton oil을 20 μl/ear로 도포하였다. 귀 두께의 측정은 croton oil을 도포한 후 5시간 후에 실시하였으며, croton oil로 인한 귀 두께의 증가를 부종의 형성으로 간주하였다. 조직 관찰은 100 mg/ml 농도의 밀배아유를 마우스 오른쪽 귀에 20 μl 도포하고 15분 뒤 5% croton oil을 20 μl 도포하였다. 6시간 후에 diethyl ether로 마취사 시키고, 귀 조직을 절제하여 10% formaldehyde에 72시간 고정하였다. 고정 후 파라핀 블록을 만들어 박편을 제조하고 hematoxylin-eosin 및 toluidine-blue 염색을 하여 조직을 관찰하였다. 부종 생성율은 다음과 같은 식에 의해 계산하였다.

Edema formation (%) = Sample 귀 두께/Control 귀 두께 × 100

단기독성평가

단기 독성 평가는 식품의약품안전처의 제2014-136호에 고시된 “의약품등의 독성시험기준”과 OECD test guide line[29]을 참조하여 최대 허용 용량인 5,000 mg/kg body weight 기준에 따라 Balb/c 마우스에 밀배아유를 300, 2,000 및 5,000 mg/kg body weight 농도로 경구 투여하였으며, 경구 투여 전 4−6시간 정도 절식시켰다. 경구 투여 후 6시간 동안 비정상적인 행동을 관찰하였고, 2주까지 사망한 마우스가 있는지 지속적으로 관찰하였다.

통계처리

모든 실험에 대한 통계 처리는 SAS program (Statistical analytical system V8.2, SAS Institute Inc., USA)을 이용하여 one way ANOVA법으로 실시하였으며, 조사 항목들 간의 유의성 검정은 Duncan의 다중검정법으로 p < 0.05 수준에서 실시하였다.

 

결과 및 고찰

세포독성 측정

밀배아유의 항염증 효능을 탐색하기 앞서 밀배아유가 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내는지 관찰하기 위하여, 100 μg/ml의 농도를 최고농도로 하여 MTT 방법으로 세포독성을 확인하였다. MTT 결과 0.1−100 μg/ml 농도에서 PBS 처리구와 유의적인 차이가 나타나지 않아 세포에 0.1−100 μg/ml에서는 세포생존율에 영향을 주지 않았다(Fig. 1). 이는 밀배아유의 항염증 효과가 세포 독성에 의한 것이 아니며, 밀배아유의 염증 조절 매개 물질의 활성을 억제시키는 물질에 기인한 것으로 사료된다.

Fig. 1.Effect of wheat germ oil on proliferation of RAW 264.7 cells. Proliferation index (%) = sample O.D./control O.D. × 100. ND : not significantly different.

Nitric oxide 생성 억제효과

LPS 자극에 의한 RAW 264.7 세포에서 증가된 NO 분비량에 대한 밀배아유의 영향을 알아보기 위하여, 배양액 중에 생성된 nitrite의 양을 조사하였다. NO는 NOS에 의하여 L-arginine으로부터 생성되는 무기유리체로 면역반응, 세포독 신경전달계 및 혈관이완 등의 여러 생물학적 과정에 관여하며[19] 병리적인 조건하에서 iNOS에 의한 NO의 현저한 증가는 다른 염증성 매개체들과 함께 과도한 염증을 유발하는 염증성 손상의 주요 매개체이다[24, 25]. LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포는 NO의 생성이 55.8 μM로 현저히 증가되었으나, 밀배아유를 10−100 μg/ml로 처리하였을 때 농도 의존적으로 NO의 분비량이 감소되는 것으로 나타났다. 특히 50 및 100 μg/ml 농도에서 NO의 생성량이 36.6 및 34.7 μM로 나타나 36% 및 40%의 감소효과를 나타내었다(Fig. 2). 이는 sandalwood essential oil이 250 μg/ml 농도에서 약 30%의 NO 분비량 억제 효과를 나타내었다고 보고하였으며[31], Camellia japonica oil은 100 μg/ml 농도에서 LPS로 증가된 NO의 분비량이 약간 감소하여[20], 밀배아유에 의한 NO 분비량 감소 효과가 좋은 것으로 사료된다. 밀배아유에는 불포화지방산인 oleic acid와 linoleic acid 함량이 높으며, 불포화 지방산이 염증 반응에 관여하는 NO의 분비량 감소에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다[5, 30]. 따라서, 밀배아유에서 불포화지방산이 염증 매개 물질인 NO의 분비량 감소에 영향을 미치는 것으로 사료된다.

Fig. 2.Inhibitory effect of wheat germ oil on the production of nitric oxide in RAW 264.7 cells. a-gMeans with different superscripts are significantly different (p< 0.05).

염증관련 cytokines 생성 억제효과

인체에서 염증반응이 진행되기 위해서는 면역반응에서 필연적으로 염증성 사이토카인이 동반되는데, 대표적 cytokine은 TNF-α, IL-6, IL-1β가 있다[23]. LPS에 의해 자극된 대식세포는 TNF-α를 생성하고 분비된 TNF-α는 IL-1β와 IL-6 생성을 유도함으로써 염증반응을 지속시키게 된다[2]. TNF-α는 세포간 세포 부착 분자(intracellular adhesion molecule-1) 및 혈관 세포 부착 분자(vascular cell adhesion molecule-1)의 조절을 통해 전 염증 활성이 나타내게 되며, 염증부위에 백혈구가 유입되게 된다[1]. IL-6는 pro-inflammatory/anti-inflammatory 특성을 지닌 cytokine으로 면역과 염증 반응에 중요한 역할을 하며, 과다하게 분비하게 되면 류마티스 관절염과 열과 같은 병적 증상을 나타나게 된다[33]. IL-1β는 미생물 감염에 대해 염증 반응의 초기와 발달에 중요한 요소로서 작용한다[18]. 따라서, 항염증 치료에 있어 pro-inflammatory cytokine의 분비량을 감소시키는 것이 중요하다. 본 연구에서는 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해서 생성된 pro-inflammatory cytokine의 형성을 억제하는지 알아보기 위하여 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성량을 측정하였다(Fig. 3). 밀배아유를 0.1−100 μg/ml 농도로 처리한 결과 저농도인 0.1−1 μg/ml 농도에서는 LPS 단독 처리구와 비교 시 약간 감소하였으며, 10−100 μg/ml 농도에서는 1916.5 pg/ml, 108.9 pg/ml 및 79.9 pg/ml로 LPS 처리에 의해 증가된 TNF-α 분비량이(2400.7 pg/ml) 각각 25%, 95%, 97% 정도 억제되었다. IL-6의 분비량 측정 결과, LPS 처리에 의해 235.9 pg/ml로 증가하였으며, 0.1 μg/ml 농도에서 135.8 pg/ml로 42%의 감소 효과를 나타내었고, 50 및 100 μg/ml 농도에서는 40.3 pg/ml와 13.5 pg/ml로 각각 82.9% 및 94.3%의 큰 억제 효과를 나타내었다. IL-1β의 분비량은 LPS 처리에 의해 22.5 pg/ml로 증가하였으며, 농도가 증가할수록 감소 효과를 보였으며, 50 μg/ml 농도에서 13.2 pg/ml로 41% 정도 억제 효과를 보였으며, 100 μg/ml 농도에서 10.3 pg/ml로 54% 감소한 것으로 나타났다. 본 연구 결과에서 LPS 처리로 인해 증가된 전염증성 cytokine의 분비량이 밀배아유를 50−100 μg/ml 농도로 처리시 상당한 감소효과를 나타내었다. 이는 NF-κB p65와 MAPKs (p-ERK, p-JNK)의 western blot 결과(Fig. 4, 5)에서 높은 농도인 50−100 μg/ml 농도에서 LPS 단독 처리구와 비교시 발현량의 감소가 크게 나타나, NF-κB와 MAPKs의 활성 조절에 의해 분비량 감소가 크게 나타난 것으로 사료된다. Sandalwood essential oil 및 Camellia japonica oil은 250 μg/ml 이상의 농도에서 염증성 cytokine의 분비량 감소에 효과를 보여[20, 31], 밀배아유가 LPS로 유도된 염증성 cytokine의 분비 조절에 더 효과적인 것으로 사료된다. 이상으로, 밀배아유는 pro-inflammatory cytokine의 분비를 억제함으로써 염증 반응을 효과적으로 조절 할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 3.Inhibitory effect of wheat germ oil on production of TNF-α, IL-6, and IL-1β in RAW 246.7 cells. a-fMeans with different superscripts are significantly different (p < 0.05).

Fig. 4.Inhibitory effects of WGO on the protein expression of iNOS, COX-2 and NK-κB p65 in RAW 264.7 cells. The levels of iNOS and COX-2 in the cytosolic protein, and the NF-κB p65 in nuclear protein were determined by western blot analysis. RAW 264.7 cells were treated with the indicated concentrations of WGO (0.1, 1, 10, 50, and 100 μg/ml) and LPS (1 μg/ml) for 18 h or 30 min and the proteins were detected using specific antibodies. For quantification, the expression data were normalized to the β-actin signal. Data are obtained from three independent experiments and expressed as means ± SD. Means with different letters (a-e) above the bars are significantly different (p < 0.05).

Fig. 5.Inhibitory effects of wheat germ oil on the protein expression of p-p38, p-ERK, and p-JNK in RAW 264.7 cells. The levels of p-p38, p-ERK, and p-JNK in the cytosolic protein were determined by western blot analysis. RAW 264.7 cells were treated with the indicated concentrations of WGO (0.1, 1, 10, 50, and 100 μg/ml) and LPS (1 μg/ml) for 30 min, and the proteins were detected using specific antibodies. For quantification, the expression data were normalized to to the β-actin signal. Data are obtained from three independent experiments and expressed as means ± SD. Means with different letters (a−g) above the bars are significantly different (p < 0.05).

iNOS, COX-2 및 NF-κB p65 발현 억제 효과

LPS로 유도한 밀배아유가 RAW 264.7 세포에서 염증반응의 지표인 iNOS 및 COX-2 생성 및 NF-κB p65에 미치는 영향을 알아보고자 Western blot법을 이용하여 단백질의 발현 억제정도를 알아보았다. 포유동물 세포의 NOS의 경우, 유사형태 3가지 존재하는데 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS), 그리고 iNOS이다[27]. 이중 nNOS 및 eNOS는 항상 발현되어있으며 iNOS는 일부 세포에서 LPS, cytokine 및 박테리아 독소 같은 자극들에 노출되는 경우 발현되며 염증반응에 관여하게 된다[35]. COX는 arachidonic acid를 prostaglandin으로 촉진시키는 효소로써, 신체의 항상성 유지에 관여하며 대부분의 조직에서 정상적인 상태에 발현하는 COX-1과 일부 신생조직이나 염증, 기타 면역반응시 세포분열인자나 cytokine에 의해 염증 부위에서 발현이 증가되는 COX-2가 있다[8]. NF-κB는 일반적인 세포에서 p65와 p50의 heterodimer 형태로 cytosol에 존재하며, IκB와 결합이 되어 있어 핵으로의 이동을 막아 전사인자로써의 역할을 하지 못하게 된다. 하지만 LPS와 cytokine 등의 다양한 자극으로 인하여 IκB가 인산화 됨으로써 분해되어 NF-κB가 핵으로 이동하여 전사인자로써 역할을 하여 iNOS, COX-2 및 염증관련 cytokine을 합성한다[11, 26]. 본 연구에서는 RAW 264.7 세포에 밀배아유를 0.1−100 μg/ml 농도로 처리하여 iNOS, COX-2, NF-κB p65의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. iNOS의 경우, LPS 처리에 의해 발현이 증가 하였으며, 0.1−50 μg/ml 농도 범위에서는 LPS 단독 처리군에 비해 발현이 약간 감소하였으나, 100 μg/ml 농도로 처리하였을 때 iNOS의 발현이 크게 감소하였다. 이에, Fig. 2에서의 NO 분비량 감소는 iNOS의 발현 저해에 의한 것임을 확인하였다(Fig. 4). COX-2의 발현은 LPS 단독 처리에 의해 증가하였으며, 0.1−10 μg/ml 농도에서는 발현 저해 효과가 없었으나, 50 μg/ml 농도에서 약간 감소하여 100 μg/ml 농도에서 발현 억제가 증가하였다. NF-κB p65에서는 10−50 μg/ml에서 단백질 발현이 약간 저해되었으며, 100 μg/ml 농도에서 억제효과가 증가하였다. 이는 밀배아유가 NF-κB signaling을 통해 iNOS, COX-2 및 염증관련 cytokine의 발현 및 생성을 조절하는 것으로 사료된다. 불포화 지방산 oleic acid는 NF-κB 활성 저해를 통한 iNOS와 COX-2의 발현 감소로 염증 작용을 조절한다고 알려져 있어[30], 밀배아유에 높게 함유된 불포화 지방산이 NF-κB signaling pathway에 관여하여 염증 매개 물질 조절을 통한 항염증 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

MAPKs 발현 억제 효과

MAPKs는 serine/threonine kinase로 p38, ERK, JNK로 분류된다. MAPKs의 인산화를 통한 활성화는 대식세포가 LPS로 인한 자극 반응에 의해 나타나며 이는 염증과 관련된 전염증성 cytokine 및 iNOS의 분비를 증가시킨다[22]. 또한 MAPKs pathway는 LPS에 의한 NF-κB의 신호 활성화에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[3]. 따라서, 밀배아유가 MAPKs의 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위해, LPS에 의해 증가하는 MAPKs의 인산화 변화를 Western blot을 통해 확인하였다. 그 결과(Fig. 5), LPS 처리에 의해 p-p38, p-ERK 및 p-JNK의 발현이 증가하였고, 밀배아유의 처리에 의한 발현량 변화를 보면, p-p38 경우 저농도에서는 발현 억제효과가 거의 없었으나, 10−100 μg/ml 농도로 처리시에는 발현량이 약간 감소하였다. p-ERK의 발현량은 0.1 μg/ml에서 발현량이 감소하였으며, 농도가 증가함에 따라 발현량의 감소가 크게 나타났다. p-JNK의 경우는, 10 μg/ml 농도에서 감소효과가 뚜렷이 나타나기 시작하여, 100 μg/ml 농도에서 발현 억제가 가장 컸다. Kim 등[20]의 연구에서는 LPS에 의해 증가된 ERK, p38, JNK의 인산화의 발현이 Camellia japonica oil를 250 μg/ml 농도 이상에서 감소효과가 크게 나타나, 밀배아유의 JNK와 ERK 인산화 발현 억제 효과가 더 뛰어난 것으로 사료된다. 따라서, 밀배아유는 염증반응에 의해 활성화 되는 p-ERK와 p-JNK MAPKs의 활성 조절을 통해 항염증 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

귀 부종 억제 효과 및 조직 관찰

피부염증에서 일어나는 대표적 반응으로 염증 반응 시 혈관 확장, 세포막 유동성 증가, 부종 등의 생리현상이 수반되며 이 반응을 억제하는 효과를 실험적으로 검증함으로써 특정 물질의 항염증 효능을 증명할 수 있다[10]. 따라서 밀배아유를 10, 50 및 250 mg/kg 농도로 200 μl씩 경구투여 한 후, croton oil로 염증을 유발한 후, 귀 두께를 측정한 결과 Fig. 6과 같다. Control구와 비교하였을 때, 모든 농도에서 유의적으로 귀 두께가 감소한 것을 확인하였다. 특히, 밀배아유를 250 mg/kg 농도로 경구 투여 하였을 때, positive control인 prednisolone 10 mg/kg 처리구와 유사한 귀 부종 억제 효과를 나타내었다. 또한 조직관찰 결과에서, croton oil만을 처리한 경우에 경피와 진피의 두께가 증가하였으나, 밀 배아유를 100 mg/ml 농도로 처리한 경우 경피 및 진피 두께가 얇아진 것을 확인하였다(Fig. 7A). 그리고 조직내의 mast cell 침윤 정도를 toluidine-blue 염색을 통해 확인한 결과(Fig. 7B), prednisolone 처리구와 유사한 정도로 진피에서의 mast cell 침윤을 억제함을 확인하였다. 불포화 지방산인 linoleic acid와 oleic acid의 함량이 높은 pumpkin seed oil의 귀부종 test 결과에서 positive control구에 비해 귀부종 형성, 진피 및 경피의 두께, 염증관련 cell 수가 억제되었다고 보고 하였으며, 이는 불포화지방산이 피부 염증 반응 조절에 중요한 역할을 한 것이라 보고하였다[6]. 따라서 밀배아유가 귀부종 완화에 효과적인 것은 불포화 지방산에 의한 염증 반응 조절에 기인한 것으로 사료되며, 천연 항염증 소재로 이용될 가치가 충분한 것으로 사료된다.

Fig. 6.Inhibition of wheat germ oil (WGO) against croton oil-induced mouse ear edema. a-dMeans with different superscript are significantly different (p < 0.05).

Fig. 7.Photomicrograph of transverse sections of mice ears sensitized with topical application of 5% croton oil (v/v) in acetone (a-c) or vehicle acetone (d), stained with (A) hematoxylin-eosin and (B) toluidine-blue examined under light microscopy (magnification: 200×). Treatments: vehicle 2% Tween 80 (a), prednisolone 0.08 mg/ear (b) and wheat germ oil 20 μl/ear (c). The numbers 1 and 2 indicate dermis and epidermis, respectively and the arrow in (B) means infiltration of mast cells.

단기독성평가

본 연구에서 밀배아유의 항염증 효과를 확인하였으며, 이를 천연 항염증제로 활용하기 위해서는 안전성이 확보되어야 하기 때문에, 이를 위한 안전성 실험으로 급성경구독성을 다음과 같이 실시하였다. 밀배아유를 300, 2,000 및 5,000 mg/kg 농도로 200 μl씩 경구 투여하고 2주간 행동변화 및 치사율을 관찰한 결과(Table 1), 최대용량 5,000 mg/kg에서 관찰 특이적인 행동변화를 보이지 않았으며, 2주간의 치사율은 0%인 것으로 나타났다. 따라서 밀배아유는 단기 급성 경구독성에서도 이상행동이나 사망이 발생하지 않았기 때문에 천연 항염증제로서 안전한 기능성 소재로 이용이 가능할 것으로 사료되어진다.

Table 1.Mortality of mice treated orally with wheat germ oil.