Effect of Lespedezea Cuneata on the Contraction of Rabbit Common Carotid Artery and Corpus Cavernosum

야관문(夜關門)이 토끼의 혈관과 음경해면체 수축에 미치는 영향

Abstract

The aim of this study was to evaluate the mechanism of vasodilation of Lespedezea cuneata(LC) in rabbit common carotid artery and cavernosal smooth muscle. LC relaxed arterial strips precontracted with norepinephrine and cavernosal strips precontracted with phenylephrine. The arterial relaxation effects of LC was endothelium-dependent. $N{\omega}$-nitro-L-arginine(L-NNA), NOS inhibitor, methylene blue(MB), cGMP inhibitor, indomethacin(IM), cyclo-oxygenase inhibitor and tetraethylammonium chloride(TEA), KCa-channel blocker attenuate the relaxation responses of LC in arterial strips. In $Ca^{2+}$-free krebs-ringer solution, pretreatment of LC extract significantly reduced the contraction induced by addition $Ca^{2+}$. L-NNA reduced LC extract-induced relaxation in cavernosal strips, but IM, TEA and MB didn't affect LC extract-induced relaxation. When LC extract was applicated on human umbilical vein endothelial cell, the nitric oxide concentration was increased. We conclude that in rabbit common carotid artery, LC may suppress influx of extra-cellular $Ca^{2+}$ through the release of endothelium derived relaxing factor including nitric oxide, prostacyclin, endothelium derived hyperpolarizing factor. And LC exerts a relaxing effect on corpus cavernosum through activating the NO.

서 론

夜關門은 콩과의 싸리속에 속하는 식물로 비수리, 三葉草 등으로 불리며, 명칭에 밤에 빗장을 열어준다는 의미를 가지고 있어 민간에서 양기부족, 조루증을 비롯하여 기침, 천식 등에 활용되어 왔다.

夜關門은 氣味가 苦辛하고 凉하며, 肺‧肝‧腎經으로 歸經하는 약물로 肝腎과 肺陰을 補益하고 散瘀消腫하는 효능이 있어 遺精, 遺尿, 帶下, 哮喘, 勞傷, 視力減退, 目赤과 乳癰의 치료에 사용되고 있고1), 성분으로는 flavonoid류로 quercetin, kaempferol, vitexin, orientin 등을 함유하고 있다2).

夜關門에 대한 연구를 살펴보면 夜關門 메탄올 추출물이 항산화작용3)과 α-glucosidase 저해활성작용4)이 있으며, 夜關門 추출물의 ethyl acetate 분획이 비듬균인 P. ovale과 황색포도상구균인 S. aureus에 대한 항균활성작용5)을 나타내었고, 인슐린 분비를 촉진6)시키고, 피부 광노화 억제효과7)가 있는 것으로 보고되었다.

특히 夜關門이 산화질소-cGMP계를 통한 내피세포 의존성 혈관이완작용8)이 있고, 夜關門 메탄올 추출물의 n-hexane층이 토끼의 음경해면체 평활근에 대한 이완효과9)가 있는 것으로 보고되어 심혈관 질환과 발기부전의 치료에 활용할 수 있는 약물로 알려져 있다.

혈관의 이완에는 자율신경계의 활동과 혈관활성물질 및 혈관내피세포에서 분비되는 수축과 이완에 관여하는 인자가 작용하며, 그 중 prostacyclin, nitric oxide(NO), endothelium derived hyperpolarizing factor(EDHF)가 대표적인 혈관내피세포성 이완인자에 해당한다.

또한 발기부전(erectile dysfunction, ED)은 발기를 일으키지 못하거나 발기를 유지하지 못하는 상태로 혈관이완의 여부가 발기반사(erection reflex) 및 발기 지속여부에 중요한 역할을 하고, 혈관을 이완시키는 인자로는 비신경전달물질인 prostaglandin과 EDRF에 의해 음경해면체 평활근의 이완이 일어나며10,11), EDRF가 NO인 것으로12) 밝혀졌다.

따라서 夜關門의 혈관이완작용이 혈관내피세포성 이완인자의 작용을 통하여 이루어지므로 음경 해면체에서 혈관평활근을 이완시키는 작용 역시 혈관내피세포성 이완인자의 작용과 관계가 있을 것으로 예상된다.

이에 저자는 토끼의 경동맥과 음경해면체를 이용한 organ bath study를 통하여 혈관내피세포성 이완인자인 EDHF, NO, prostacyclin을 중심으로 夜關門의 경동맥과 음경해면체 평활근에 대한 이완효과와 작용기전 및 혈관내피세포에서 NO의 생성에 미치는 영향에 대한 연구에서 유의한 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.

 

재료 및 방법

1. 실험동물

체중 1.5~2.0 kg 내외의 New Zealand white 수컷 토끼(샘타코, 한국)를 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 1주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 본 동물실험은 세명대학교 동물실험윤리위원회의 승인하에 실시되었다.

2. 夜關門 추출물 제조

夜關門(Lespedezea cuneata) 200 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 round flask에 넣고 2시간 동안 가열 추출한 다음 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축하였다. 농축액을 동결건조기로 건조하여 얻은 분말 61.2 g을 실험에 사용하였다.

3. 夜關門이 수축 혈관과 해면체에 미치는 영향

1) 실험절편의 제작

토끼를 urethane(0.6 g/㎏, 정맥주사)으로 마취한 다음 음경과 경동맥을 적출하여 modified krebs-ringer bicarbonate solution(125.4 mM NaCl, 4.9 mM KCl, 2.8 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 15.8 mM NaHCOs, 1.2 mM KH2PO4, 12.2 mM glucose, pH 7.4)에서 주위의 근육과 지방조직을 제거하였다. 실험절편은 음경해면체 주위의 백막을 제거한 다음 2×2×6 ㎜ 크기의 절편으로 만들었고, 혈관은 2 ㎜ 길이의 고리형태 혈관절편을 제작하였다.

2) 등장성 수축 측정

실험절편은 95%의 O2와 5%의 CO2 혼합가스로 포화된 37℃의 modified krebs-ringer bicarbonate solution이 peristaltic pump를 통하여 3 ㎖/min의 속도로 흐르고 있는 organ bath(용량 1.5 ㎖)에 현수하였다. 실험절편의 한쪽 끝은 organ bath의 바닥에 고정시키고 다른 쪽은 force transducer에 연결하여 장력을 측정하고 그 결과를 physiograph(PowerLab, Australia)로 기록하였다.

실험시작 전 실험절편을 organ bath에서 1시간 안정시킨 후 micromanipulator(Narishige N2, Japan)를 이용하여 피동장력 1g을 가하고 다시 1시간 안정시킨 다음 실험을 진행하였으며, 연속되는 실험에는 다른 처치 전에 다시 1시간 안정시킨 다음 시행하였다.

3) 夜關門이 수축혈관에 미치는 영향

(1) Norepinephrine(NE)으로 수축된 실험절편에서의 수축변화 측정

실험절편에 NE 5 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물을 농도별(0.01, 0.03, 0.1, 0.3 ㎎/㎖)로 투여하여 이완효과의 변화를 기록하였다.

(2) 혈관내피세포 유무에 따른 이완효과의 변화 측정

혈관내피세포가 존재하는 혈관절편과 혈관내피세포가 제거된 혈관절편에 NE 5 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물(0.3 ㎎/㎖)을 투여하여 이완효과의 변화를 비교하였다.

(3) Indomethacin(IM)의 전처치에 따른 이완효과의 변화 측정

실험절편을 IM 10 μM로 15분간 전처치하고 NE 5 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물(0.3 ㎎/㎖)을 투여하여 IM을 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.

(4) Tetraethylammonium chloride(TEA)의 전처치에 따른 이완효과의 변화 측정

실험절편을 TEA 10 μM로 15분간 전처치하고 NE 5 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물(0.3 ㎎/㎖)을 투여하여 TEA를 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.

(5) Nω-nitro-L-arginine(L-NNA)의 전처치에 따른 이완효과의 변화 측정

실험절편을 L-NNA 10 μM로 15분간 전처치하고 NE 5 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물(0.3 ㎎/㎖)을 투여하여 L-NNA을 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.

(6) Methylene blue(MB)의 전처치에 따른 이완효과의 변화 측정

혈관절편을 MB 1 μM로 15분간 전처치하고 NE 5 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물(0.3 ㎎/㎖)을 투여하여 MB를 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.

(7) 夜關門의 전처치에 따른 Ca2+ 의존성 수축변화 측정

혈관절편을 Ca2+-free solution에서 夜關門 추출물(0.3 ㎎/㎖)로 10분간 전처치하고 NE 5 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 Ca2+ 1 mM을 투여하여 夜關門을 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.

4) 夜關門이 수축 음경해면체에 미치는 영향

(1) Phenylephrine(PE)으로 수축된 해면체에서의 수축변화 측정

해면체절편에 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물을 농도별(0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖)로 투여하여 수축의 변화를 기록하였다.

(2) Indomethacin(IM)이 해면체 이완효과에 미치는 영향

해면체절편을 먼저 IM 10 μM로 15분간 처치하고 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물(3.0 ㎎/㎖)을 투여하여 IM을 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.

(3) Tetraethylammonium chloride(TEA)가 해면체 이완효과에 미치는 영향

해면체절편을 TEA 10 μM로 15분간 전처치하고 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물(3.0 ㎎/㎖)을 투여하여 TEA를 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.

(4) Nω-nitro-L-arginine(L-NNA)이 해면체 이완효과에 미치는 영향

해면체절편을 L-NNA 10 μM로 15분간 전처치하고 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물(3.0 ㎎/㎖)을 투여하여 L-NNA을 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.

(5) Methylene blue(MB)가 해면체 이완효과에 미치는 영향

해면체절편을 MB 1 μM로 15분간 전처치하고 PE 1 μM을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 夜關門 추출물(3.0 ㎎/㎖)을 투여하여 MB를 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.

5) 세포실험

사람의 제대정맥내피세포인 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)은 CloneticsTM and PoieticsTM (Lonza, USA)에서 구입하여 passage 3~7번까지 사용하였으며, 세포배양을 위해 endothelial cell basal medium-2(EBM-2) bullet kit (Lonza, USA)을 이용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. EBM-2 배지는 사용 전 EGM-2 SingleQuots(10% fetal bovine serum, hydrocortisone, hFGF-B, vEGF, R3-IGF-I, ascorbic acid, hEGF. GA-1000, heparin)을 넣고 잘 섞어서 사용하였다. 70~80%정도 confluent한 세포는 HEPES-buffered saline solution을 주입하여 씻어내고, trypsin/EDTA solution(2 ㎖)을 넣어 flask에 부착된 세포를 떼어낸 후 trypsin neutralizing solution을 첨가하여 원심분리(220 xg, 5분)하였다. 침전물에 새로운 배지를 넣어서 cell count하여 세포를 96-well plate(5×103 cells/well)에 심은 다음 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다.

(1) 세포독성 측정

Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 배지로 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 배양한 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)에 夜關門 추출물을 농도별로 처리한 다음 24시간 배양하여 세포생존율을 MTT assay로 측정하였다16). MTT(methylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, 5 ㎎/㎖)를 20 ㎕ 넣고, 세포 배양기에서 2시간 방치하였다. 상층액을 제거한 뒤 formazan 침전물은 DMSO를 200 ㎕씩 넣어 약 15분간 녹였다. 540 ㎚의 파장에서 ELISA microplate reader로 흡광도를 측정하여 세포생존율을 계산하였다.

(2) Nitric oxide 측정

Nitric oxide(NO) 생성 정도는 Griess reaction17)에 준하여 microplate reader로 NO 생성의 지표인 배지에 생성된 nitrite 양을 측정하여 결정하였다. 夜關門처리 24시간 후에 배양액 50 ㎕에 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.1% naphtylethylene diamide 및 2.5% 인산)를 동량 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. Nitrite 양의 측정은 sodium nitrite를 농도별로 조제하여 만든 표준곡선을 이용하여 산출하였고, 생성된 nitrite의 양은 μM로 환산하여 나타내었으며, 각 실험에서 기본 대조군은 세포 배양액을 사용하였다.

4. 통계분석

실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었고, 해면체 및 혈관 수축의 변화는 실제 수축의 크기와 NE 및 PE를 투여하여 유발된 최고 수축에 대한 백분율로 표현하였다. 실험결과의 비교는 student's t-test를 시행하였고, 유의성은 p<0.05로 판정하였다.

 

결 과

1. 夜關門이 수축혈관에 미치는 영향

1) NE로 수축된 혈관에서의 수축변화

NE에 의하여 0.98±0.29 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물을 농도별로 투여하였을 때 0.1 ㎎/㎖에서 0.35±0.16 g(36.7%), 0.3 ㎎/㎖에서 0.33±0.15 g(34.0%)의 수축을 나타내어 유의성 있는 이완효과를 관찰할 수 있었다.

Fig. 1.Effects of LC extract on NE-contracted rabbit carotid arterial strip(n=8). Representative tracings are shown as the relaxation of arterial strip by cumulative addition of 0.01 ㎎/㎖ to 0.3 ㎎/㎖ LC extract at the plateau of NE-induced contraction. NE, norepinephrine 5 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(㎎/㎖) ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

2) 내피세포 유무에 따른 이완효과의 변화

혈관내피세포가 존재하는 경우 NE에 의하여 1.47±0.24 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖을 투여하였을 때 0.51±0.18 g(35.9%)의 수축을 나타내어 유의성 있는 이완효과가 관찰되었으나, 혈관내피세포가 제거된 경우 NE에 의하여 1.55±0.33 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖을 투여하였을 때 1.72±0.37 g(110.8%)의 수축을 나타내어 夜關門의 혈관이완효과가 유의하게 억제되었다.

3) IM의 전처치에 따른 이완효과의 변화

IM을 전처치하지 않은 경우 NE에 의하여 1.16±0.19 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖ 투여 시 0.43±0.13 g(38.6%)의 수축을 나타내었으나, IM을 전처치한 경우 NE에 의하여 0.93±0.32 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖ 투여 시 0.54±0.19 g(60.7%)의 수축을 나타내어 IM을 전처치한 경우에 혈관이완효과가 유의하게 억제되었다.

Fig. 2.Effects of LC extract on NE-contracted rabbit carotid arterial strip in the absence and presence of endothelium(n=8). Representative tracings are shown as the relaxation of arterial ring by LC extract at the plateau of NE-induced contraction in ED-intact or ED-denuded arterial strip. ED, endothelium ; NE, norepinephrine 5 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(0.3 ㎎/㎖) ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

Fig. 3.Effects of LC extract on NE-contracted rabbit carotid arterial strip in the absence and presence of IM(n=16). Representative tracings are shown as the relaxation of arterial strip by LC extract at the plateau of NE-induced contraction in IM treated or IM non-treated arterial strip. NE, norepinephrine 5 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(0.3 ㎎/㎖) ; IM, indomethacin 10 μM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

Fig. 4.Effects of LC extract on NE-contracted rabbit carotid arterial strip in the absence and presence of TEA(n=16). Representative tracings are shown as the relaxation of arterial strip by LC extract at the plateau of NE-induced contraction in TEA treated or TEA non-treated arterial strip. NE, norepinephrine 5 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(0.3 ㎎/㎖) ; TEA, tetraethylammonium chloride 10 μM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

4) TEA의 전처치에 따른 이완효과의 변화

TEA를 전처치하지 않은 경우 NE에 의하여 1.47±0.24 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖ 투여 시 0.51±0.18 g(35.9%)의 수축을 나타내었으나, TEA를 전처치한 경우 NE에 의하여 1.41±0.26 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖ 투여 시 1.22±0.30 g(89.3%)의 수축을 나타내어, TEA를 전처치한 경우에 혈관이완효과가 유의하게 억제되었다.

5) L-NNA의 전처치에 따른 이완효과의 변화

L-NNA를 전처치하지 않은 경우 NE에 의하여 1.11±0.18 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖ 투여 시 0.47±0.12 g(43.3%)의 수축을 나타내었으나, L-NNA를 전처치한 경우 NE에 의하여 1.73±0.25 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖ 투여 시 1.59±0.23 g(92.4%)의 수축을 나타내어, L-NNA를 전처치한 경우에 혈관이완효과가 유의하게 억제되었다.

Fig. 5.Effects of LC extract on NE-contracted rabbit carotid arterial strip in the absence and presence of L-NNA(n=12). Representative tracings are shown as the relaxation of arterial strip by LC extract at the plateau of NE-induced contraction in L-NNA treated or L-NNA non-treated arterial strip. NE, norepinephrine 5 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(0.3 ㎎/㎖) ; L-NNA, Nω-nitro-L-arginine 10 μM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

6) MB의 전처치에 따른 이완효과의 변화

MB를 전처치하지 않은 경우 NE에 의하여 1.22±0.14 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖ 투여 시 0.38±0.11 g(31.6%)의 수축을 나타내었으나, MB를 전처치한 경우 NE에 의하여 1.52±0.30 g(100%) 수축된 혈관에 夜關門 추출물 0.3 ㎎/㎖ 투여 시 1.06±0.30 g(69.2%)의 수축을 나타내어, MB를 전처치한 경우에 혈관이완효과가 유의하게 억제되었다.

Fig. 6.Effects of LC extract on NE-contracted rabbit carotid arterial strip in the absence and presence of MB(n=8). Representative tracings are shown as the relaxation of arterial strip by LC extract at the plateau of NE-induced contraction in MB treated or MB non-treated arterial strip. NE, norepinephrine 5 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(0.3 ㎎/㎖) ; MB, methylene blue 1 μM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

7) 夜關門의 전처치에 따른 Ca2+ 의존성 수축의 변화

Ca2+이 제거된 krebs-ringer solution에서 夜關門을 전처치하지 않은 경우 NE로 수축을 유발시킨 후 Ca2+ 1 mM을 투여하였을 때 1.01±0.19 g의 수축을 나타내었으나, 夜關門을 전처치한 경우 NE로 수축을 유발시킨 후 Ca2+ 1 mM을 투여하였을 때 0.45±0.32 g의 수축을 나타내어, 夜關門을 전처치한 경우 Ca2+ 투여로 인한 수축의 증가가 유의하게 억제되었다.

Fig. 7.Effects of LC extract on influx of extracellular Ca2+ in isolated rabbit common carotid artery(n=16). Representative tracings are shown as the relaxation of arterial strip by Ca2+ at the plateau of NE-induced contraction in LC extract treated or LC extract non-treated arterial strip. NE, norepinephrine 5 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(0.3 ㎎/㎖) ; Ca2+, calcium chloride 1 mM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

2. 夜關門이 수축 음경해면체에 미치는 영향

1) PE로 수축된 해면체에서의 수축변화

PE에 의하여 0.90±0.14 g(100%) 수축된 해면체에 夜關門 추출물을 농도별로 투여하였을 때 0.3 ㎎/㎖에서 0.74±0.17 g(81.2%), 1.0 ㎎/㎖에서 0.67±0.23 g(72.3%), 3.0 ㎎/㎖에서 0.48±0.18 g(52.1%)의 수축을 나타내어 유의성 있는 이완효과를 관찰할 수 있었다.

Fig. 8.LC extract-induced concentration-dependent relaxation in isolated rabbit corpus cavernosum(n=10). Representative tracings are shown as the relaxation of corpus cavernosal strip by cumulative addition of 0.01 ㎎/㎖ to 3.0 ㎎/㎖ LC extract at the plateau of PE-induced contraction. PE, phenylephrine 1 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(㎎/㎖) ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

2) IM이 해면체 이완효과에 미치는 영향

IM을 전처치하지 않은 경우 PE에 의하여 0.93±0.23 g(100%) 수축된 해면체에 夜關門 추출물 3.0 ㎎/㎖을 투여하였을 때 0.65±0.25 g(68.2%)의 수축을 나타내었고, IM을 전처치한 경우 PE에 의하여 0.80±0.19 g(100%) 수축된 해면체에 夜關門 추출물 3.0 ㎎/㎖을 투여하였을 때 0.55 ± 0.18 g(68.0%)의 수축을 나타내어, IM의 전처치가 夜關門의 해면체 이완효과에 영향을 미치지 않았다.

Fig. 9.Effects of LC extract on PE-contracted rabbit corpus cavernosum in the absence and presence of IM(n=7). Representative tracings are showm as thet relaxation of corpus cavernosal strip by LC extract at the plateau of PE-induced contraction in IM treated or IM non-treated corpus cavernosum. PE, phenylephrine 1 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(3.0 ㎎/㎖) ; IM, indomethacin 10 μM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

4) TEA가 해면체 이완효과에 미치는 영향

TEA를 전처치하지 않은 경우 PE에 의하여 0.93±0.23 g(100%) 수축된 해면체에 夜關門 추출물 3.0 ㎎/㎖을 투여하였을 때 0.67±0.14 g(73.0%)의 수축을 나타내었고, TEA를 전처치한 경우 PE에 의하여 0.87±0.21 g(100%) 수축된 해면체에 夜關門 추출물 3.0 ㎎/㎖을 투여하였을 때 0.63±0.11 g(73.9%)의 수축을 나타내어, TEA의 전처치가 夜關門의 해면체 이완효과에 영향을 미치지 않았다.

Fig. 10.Effects of LC extract on PE-contracted rabbit corpus cavernosum in the absence and presence of TEA(n=8). Representative tracings are showm as thet relaxation of corpus cavernosal strip by LC extract at the plateau of PE-induced contraction in TEA treated or TEA non-treated corpus cavernosum. PE, phenylephrine 1 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(3.0 ㎎/㎖) ; TEA, tetraethylammonium chloride 10 μM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

5) L-NNA가 해면체 이완효과에 미치는 영향

L-NNA를 전처치하지 않은 경우 PE에 의하여 1.00±0.24 g(100%) 수축된 해면체에 夜關門 추출물 3.0 ㎎/㎖을 투여하였을 때 0.79±0.21 g(78.8%)의 수축을 나타내었으나, L-NNA를 전처치한 경우 PE에 의하여 1.21±0.31 g(100%) 수축된 해면체에 夜關門 추출물 3.0 ㎎/㎖을 투여하였을 때 1.11±0.26 g(92.3%)의 수축을 나타내어, L-NNA를 전처치한 경우에 夜關門의 해면체 이완효과가 유의성 있게 억제되었다.

Fig. 11.Effects of LC extract on PE-contracted rabbit corpus cavernosum in the absence and presence of L-NNA(n=8). Representative tracings are showm as thet relaxation of corpus cavernosal strip by LC extract at the plateau of PE-induced contraction in L-NNA treated or L-NNA non-treated corpus cavernosum. PE, phenylephrine 1 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(3.0 ㎎/㎖) ; L-NNA, Nω-nitro-L-arginine 10 μM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

6) MB가 해면체 이완효과에 미치는 영향

MB를 전처치하지 않은 경우 PE에 의하여 1.08±0.25 g(100%) 수축된 해면체에 夜關門 추출물 3.0 ㎎/㎖을 투여하였을 때 0.85±0.20 g(79.3%)의 수축을 나타내었고, MB를 전처치한 경우 PE에 의하여 1.13±0.27 g(100%) 수축된 해면체에 夜關門 추출물 3.0 ㎎/㎖을 투여하였을 때 0.80±0.21 g(73.2%)의 수축을 나타내어, MB의 전처치가 夜關門의 해면체 이완효과에 영향을 미치지 않았다.

Fig. 12.Effects of LC extract on PE-contracted rabbit corpus cavernosum in the absence and presence of MB(n=10). Representative tracings are showm as thet relaxation of corpus cavernosal strip by LC extract at the plateau of PE-induced contraction in MB treated or MB non-treated corpus cavernosum. PE, phenylephrine 1 μM ; LC, Lespedezea cuneata extract(3.0 ㎎/㎖) ; MB, methylene blue 10 μM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.

3. 세포 실험결과

1) 夜關門의 세포독성 측정

HUVEC에 夜關門 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정한 결과 夜關門 추출물의 농도 10, 30, 50, 100, 300, 500, 1000 ㎍/㎖에서 모두 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다.

2) 夜關門이 NO의 생성에 미치는 영향

HUVEC에 夜關門 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 NO량을 측정하였을 때 control에서 측정된 NO 생성량 1.12 ± 0.10 μM에 비하여 夜關門 추출물 100 ㎍/㎖의 농도에서 1.36 ± 0.06 μM, 300 ㎍/㎖의 농도에서 1.96 ± 0.09 μM, 500 ㎍/㎖의 농도에서 2.50 ± 0.09 μM, 1000 ㎍/㎖의 농도에서 3.94 ± 0.10 μM로 NO의 생성이 유의성 있게 증가되었다.

Fig. 13.Effects of LC extract on the viability of HUVEC. Representative bars are shown as the cell viability in HUVEC treated LC extract(10, 100, 500 and 1000 ㎍/㎖) for 24 hr at 37℃. LC, Lespedezea cuneata extract. Values were expressed as means±S.D.

Fig. 14.Effects of LC extract on nitric oxide concentration in HUVEC. Representative bars are shown as the nitric oxide concentration in HUVEC treated LC extract(10, 100, 500 and 1000 ㎍/㎖) for 24 hr at 37℃. LC, Lespedezea cuneata extract ; NO, nitric oxide ; ** p<0.01, *** p<0.001 compared with control. Values were expressed as means±S.D.

 

고 찰

夜關門은 콩과의 싸리속에 속하는 식물로 비수리, 三葉草 등으로 불리며, 肝腎과 肺陰을 補益하는 효능이 있어 遺精, 遺尿, 目赤등의 치료에 사용되는 약물로1), 민간에서 양기부족, 조루증 등 남성의 발기부전을 개선하기 위한 식품으로 활용되고 있다.

夜關門에 대한 연구 결과에서도 夜關門의 내피세포 의존성 혈관이완작용은 내피세포에서 분비되는 NO의 작용을 통하여 cGMP를 활성화시키는 기전을 통하여 이완효과를 나타내며, 이완인자 중 EDHF, prostacyclin과는 관련이 없는 것으로 보고되었고8), 夜關門 메탄올 추출물의 n-hexane층이 토끼의 음경해면체 평활근에 대한 이완효과9)가 있는 것으로 보고되어 심혈관 질환과 발기부전의 치료에 활용할 수 있는 가능성이 제시되었다.

따라서 본 연구에서는 夜關門이 혈관과 음경해면체의 수축에 미치는 영향과 그 작용기전을 규명하고자 토끼의 경동맥과 음경해면체를 이용한 organ bath study를 통하여 혈관내피세포성 이완인자인 EDHF, NO, prostacyclin을 중심으로 연구를 진행하였다.

혈관의 수축과 이완의 조절은 혈관평활근에 분포하는 자율 신경계의 작용13)과 혈관활성물질에 대한 혈관평활근의 반응성 및 혈관의 내피세포에서 유리되는 수축과 이완에 관여하는 인자의 작용에 의하여 조절14)되는 것으로 알려져 있다.

혈관의 내피세포에서 분비되는 인자로는 endothelium-derived contracting factor(EDCF), endothelin과 같은 혈관을 수축시키는 인자와 NO, EDHF, prostacyclin과 같은 혈관을 이완시키는 인자가 모두 분비되고 있다.

혈관내피세포성 이완인자인 prostacyclin은 혈관내피세포의 arachidonic acid로부터 cyclooxygenase의 작용에 의하여 생성되고14,15), EDHF는 혈관평활근의 Ca2+-activated K+-channel의 활성화에 의해 막전압을 과분극시켜 혈관을 이완시키는 인자이며16,17), NO는 혈관내피세포의 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase(NOS)의 작용에 의하여 생성된다15,18).

본 연구에서는 夜關門의 혈관이완작용을 확인하고, 夜關門의 혈관이완효과가 세 가지 내피세포 의존성 이완인자의 작용과 연관되어 있는지를 검증하였다.

실험결과 夜關門 추출물은 0.01 ㎎/㎖에서는 수축이 증가되었으나, 0.03 ㎎/㎖에서 0.3 ㎎/㎖까지는 농도의존적인 혈관이완효과를 나타내었으며, 그 이완효과는 내피세포 의존성인 것으로 나타났다.

夜關門의 혈관이완효과는 eNOS를 선택적으로 억제하여 NO의 생성을 차단시키는 Nω-nitro-L-arginine(L-NNA)19)을 전처치하거나, NO에 의해 활성화되는 guanylate cyclase를 억제하여 NO의 작용을 차단시키는 methylene blue(MB)20,21)를 전처치하였을 때 이완효과가 억제됨으로써 夜關門은 NO/cGMP계를 통하여 이완효과를 나타낸다는 것을 확인하였으며, 이8)의 연구와도 동일한 결과를 보였다.

그러나 본 연구에서 cyclooxygenase의 활성을 억제함으로써 prostacyclin의 생성을 감소시키는 indometahcin(IM)22)을 전처치하거나, KCa-channel blocker로 K+의 유출을 차단하여 막전압의 과분극을 억제하는 tetraethylammonium chloride(TEA)17)를 전처치하였을 때에도 夜關門의 혈관이완효과가 억제됨으로써 prostacyclin과 EDHF도 관계되는 것으로 나타나 이8)의 연구와는 상반된 결과를 보였다.

혈관의 수축은 평활근 세포내 salcoplasmic reticulum과 mitochondria 등에서 유리되는 Ca2+과 세포외에서 유입되는 Ca2+에 의하여 수축이 유발되는데23,24), Ca2+-free solution에서 夜關門을 전처치하지 않고 NE로 수축시킨 다음 Ca2+을 투여하였을 때 수축이 증가되는데 비하여 夜關門을 전처치한 후 NE로 수축시킨 다음 Ca2+을 투여하였을 때는 수축의 증가가 억제됨으로써 夜關門이 세포외 Ca2+의 유입을 차단시킨 것으로 보인다.

한편 음경의 발기는 해면체 내에서 서로 연접된 그물망을 형성하고 있는 혈관 공간(cavernous vascular space)이 이완된 상태(flaccid state)에서는 해면체 공간으로 들어오는 혈액이 적어 발기가 되지 않지만, 혈관 공간 사이사이에 위치한 나선동맥(helicine artery)이 이완되어 혈액이 해면체 공간으로 유입됨으로써 발기가 된다25,26).

음경의 발기는 신경계에서 비롯되는 nNOS의 발현과 해면체 혈관계에서 비롯되는 eNOS의 발현으로 생성되는 NO에 의해 발기가 유도된다. 해면체 혈관계의 혈관내피세포에서는 L-arginine으로부터 eNOS에 의해 NO가 합성되고, 이 NO가 평활근으로 확산되어 guanylyl cyclase의 활성화를 통하여 GTP를 cGMP로 전환시키게 되면, 활성화된 cGMP가 세포내 Ca2+ 칼슘 농도를 감소시킴으로써 해면체 평활근과 소동맥을 확장시켜 발기를 일으킨다27,28).

또한 내피세포성 혈관이완인자의 하나인 prostacyclin은 내피세포의 arachidonic acid로부터 cyclooxygenase와 prostacyclin synthase의 작용을 통해 합성‧분비되어 해면체 평활근을 이완시키고29,30), EDHF는 K+ 통로를 활성화시킴으로써 K+의 세포외 유출이 일어나 세포막이 과분극됨으로 인하여 voltage-sensitive Ca2+ 통로가 불활성화되고, 그 결과 평활근세포 내 Ca2+ 농도가 감소되면 해면체 평활근이 이완된다30-32).

따라서 夜關門의 혈관이완작용이 혈관내피세포성 이완인자의 작용을 통하여 이루어지므로 음경 해면체에서 혈관평활근을 이완시키는 작용 역시 혈관내피세포성 이완인자의 작용과 관계가 있을 것으로 예상되어, 본 연구에서는 夜關門 추출물이 수축된 음경해면체에 미치는 영향과 내피세포성 이완인자와의 상관성을 검증하였다.

실험결과 夜關門 추출물은 PE로 수축된 음경해면체에서 농도의존적인 이완효과를 나타내었다. 경동맥을 이용한 organ bath study에서와 동일하게 혈관내피세포에서 NO의 생성을 차단시키는 L-NNA을 전처치하였을 때 夜關門 추출물의 이완효과가 억제되어 夜關門이 NO의 생성을 통하여 음경해면체의 평활근을 이완시키는 것으로 나타났다.

그러나 NO의 작용을 차단시키는 MB를 전처치하였을 때는 夜關門의 음경해면체 이완효과에 영향을 주지 않는 것으로 나타나 NO/cGMP의 작용기전을 고려할 때 부합되지 않는 측면이 있어 이 결과에 대해서는 지속적인 연구가 필요한 것으로 생각된다. 또한 prostacyclin의 생성을 감소시키는 IM을 전처치 하거나, EDHF의 작용을 억제하는 TEA를 전처치하였을 때에도 夜關門의 음경해면체 평활근에 대한 이완효과에 영향을 미치지 않아 prostacyclin과 EDHF는 夜關門의 음경해면체 평활근 이완효과에 관계하지 않는 것으로 판단된다.

夜關門 추출물은 human umbilical vein endothelial cell에서 농도의존적으로 NO의 생성을 증가시킴으로써 organ bath study를 통하여 확인된 夜關門 추출물이 경동맥과 음경해면체에서 NO의 생성을 통하여 경동맥과 음경해면체를 이완시킨다는 결과를 뒷받침 한다.

이상의 결과를 종합하면 夜關門은 경동맥 평활근과 음경해면체 평활근에 대한 이완효과가 있는 것으로 판단된다. 또한 경동맥에서는 혈관내피세포성 이완인자인 prostacyclin과 EDHF 및 NO가 모두 관계되고, NO/cGMP계를 통하여 세포외 Ca2+의 유입이 차단되는 기전에 의하여 혈관을 이완시키며, 음경해면체에서는 NO의 생성을 통하여 이완작용을 하는 것으로 생각된다.

 

결 론

夜關門이 혈관과 음경해면체 평활근의 수축에 미치는 영향과 작용기전을 탐구하고자, 토끼의 경동맥과 음경해면체를 이용하여 내피세포성 이완인자를 중심으로 한 organ bath study를 통하여 다음의 결과를 얻었다.

夜關門 추출물은 NE로 유발된 수축혈관에 대하여 유의성 있는 내피세포 의존성 혈관이완작용을 나타내었으며 IM, TEA, L-NNA, MB를 전처치하였을 때 夜關門 추출물의 혈관이완작용은 모두 유의성 있게 억제되었다. 또한 夜關門 추출물은 Ca2+-free solution에서 Ca2+의 첨가에 따른 수축의 증가를 유의성 있게 억제하였다.

음경해면체 평활근 수축에 대해서는 PE로 유발시킨 수축에 유의성 있는 이완작용을 나타내었으나 L-NNA의 전처치에 의해 유의성 있게 이완효과가 억제되었다.

Human umbilical vein endothelial cell에서 NO의 생성을 측정한 결과 夜關門 추출물은 NO의 생성을 유의성 있게 증가시켰다.

이상의 결과로 보아 夜關門은 경동맥 평활근과 음경해면체 평활근에 대한 이완효과가 있으며, 경동맥에서는 혈관내피세포성 이완인자의 작용에 의하여 세포외 Ca2+의 유입이 차단되는 기전에 의하여 혈관이 이완되고, 음경해면체에서는 NO의 생성을 통하여 이완되는 것으로 생각된다.