Effect of Phaseolus angularis Seed on Experimental Cellular Model of Nonalcoholic Fatty Liver Disease

적소두가 비알코올성 지방간 질환 세포 모델에 미치는 효과

Abstract

Here we tried to uncover the potential anti-lipogenic effect and the underlying mechanism of Phaseolus angularis seed in a cellular model of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) induced in HepG2 cells. Ethanol extract of Phaseolus angularis seed (JSD) was prepared. HepG2 cells were incubated in palmitate containing media to induce intracellular lipid accumulation, and co-treated with JSD for 16 hrs before examine intracellular lipid content. In control group, the cells were not co-treated with JSD. We measured the effects of JSD on liver X receptor ${\alpha}$ ($LXR{\alpha}$) and sterol regulatory element-binding transcription factor-1c (SREBP-1c) expression, transcription level of lipogenic genes, including acetyl-CoA carboxylase (ACC), fatty acid synthase (FAS), stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1), and AMP-activated protein kinase (AMPK) activation in HepG2 cells. JSD markedly reduced palmitate-induced intracellular lipid accumulation in HepG2 cells. JSD suppressed $LXR{\alpha}$/SREBP-1c expression, and SREBP-1c mediated induction of ACC, FAS, and SCD-1. Furthermore, JSD activated AMPK, which plays a major role in the control of hepatic lipid metabolism. Taken together, it is suggested that JSD has a potential to alleviate hepatic steatosis, at least in part, by suppressing $LXR{\alpha}$/SREBP-1c mediated induction of lipogenic genes. In addtion, the anti-lipogenic potential may be associated with activation of AMPK. Therefore, the Phaseolus angularis seed could be applied as a potential therapeutics for NAFLD with additional clinical studies.

서 론

지방간이란 지방이 간 조직에 과다 축적되어 간 무게의 5% 이상을 차지하는 경우를 말하여, 주요 원인으로는 비만, 당뇨, 이상지질혈증, 음주, 약물, C형 간염, 윌슨병 등이 있다. 이 중에서 음주 및 약물로 인하여 발생한 경우, 특정 질환에 속발한 경우, 또는 선천적 대사 장애 등에 의한 경우를 제외하고, 비만, 당뇨, 고지혈증 등의 대사 이상에 의해 유발된 지방간을 비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)이라고 한다1,2). 비알코올성 지방간 질환은 지방간증(hepatic steatosis)만으로 나타나기도 하지만, 지방간염(steatohepatitis)으로 진행하여, 간섬유화(hepatic fibrosis)나 간경변증(liver cirrhosis)에 이르기도 한다3). 원인 불명의 만성 간염의 70~90%가 비알코올성 지방간 질환에 의한 것으로 추정되고 있고4), 지방간염으로 진행한 경우 간경변, 간부전 및 간세포암으로 발전할 위험이 높아진다5).

치료제로는 insulin sensitizing agents, lipid lowering agents, antioxidants 등에 대한 임상 연구가 진행되었고, 근래에는 tumor necrosis factor-α (TNF-α) antagonist인 pentoxifylline, farsenoid X receptor agonists인 obeticholic acid 등에 대한 효용성이 평가 중에 있으나, 아직 표준 치료로 인정된 치료제는 없는 실정이다2,6).

적소두(赤小豆)는 콩과(Leguminosae) 팥 Phaseolus angularis Wight의 씨를 말한다7). 한의학에서는 적소두가 利水消腫, 利濕退黃, 解毒排膿 효능이 있다고 하여, 水腫, 脚氣, 黃疸, 熱毒癰腫, 丹毒 등에 사용해 왔으며7), 《東醫寶鑑》에는 “몸을 마르게 한다. 오랫동안 복용하면 피부는 검어지면서 마르게 한다. 그러므로 비만한 사람이 먹는 것이 좋다”8)는 기록이 있어 비만을 치료하는 데에도 사용되어졌음을 알 수 있다. 최근 연구에서는 항산화 작용9), 항염증 작용10), 항암작용11), 항균작용12) 등의 효능이 밝혀졌으며, 대사증후군과 연관되는 당뇨13), 고혈압14), 고콜레스테롤혈증15) 등에 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다.

비만과 인슐린 저항성은 비알코올성 지방간 질환의 발생 요인으로 작용하므로2), 비만과 인슐린 저항성을 개선시키는 약재는 비알코올성 지방간 질환에 대해서도 효능이 있을 것으로 생각되었다. 따라서, 본 연구에서는 적소두의 비알코올성 지방간질환에 대한 효능과 그 작용 기전을 조사해보고자 하였다. Palmitate는 다양한 생물체에 널리 분포하는 포화 지방산으로서, 세포 내 지방 축적을 증가시켜 비알코올성 지방간 세포 모델을 유도하는 실험들에서 보편적으로 사용되어지는 지방산의 하나이다16-18). 본 연구에서는 Palmitate를 처리하여 지방증을 유도한 HepG2 cell에 적소두 추출물이 미치는 영향을 관찰하였고, 적소두의 anti-lipogenic effect의 기전을 이해하기 위해, 적소두 추출물이 lipogenic enzymes인 acetyl-CoA carboxylase (ACC), fatty acid synthase (FAS), stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1)19,20), lipogenic enzymes 발현을 유도하는 liver X receptor α (LXRα)/sterol regulatory element-binding transcription factor-1c(SREBP-1c)21), 세포 내 에너지 저하를 감지하여 lipogenesis를 억제하는 AMP-activated protein kinase (AMPK)22)에 미치는 영향을 관찰하여 그 결과를 보고하는 바이다.

 

재료 및 방법

1. 적소두 에탄올 추출물 제조

실험에 사용된 적소두는 ㈜옴니허브로부터 구매하였다. 분쇄하여 파우더로 만든 적소두 200g을 에탄올 600ml에 섞고, 60℃에서 8 시간 동안 추출 후 여과하였다. 동일한 추출 과정을 한번 더 시행한 다음, 여과액을 모아 감압 농축하고 동결 건조하여 2.08g의 추출물을 얻었다 (수율 1%).

2. 재료

3 (4,5 dimethylthiazol 2 yl) 2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT), Palmitate, Nile Red, T0901317 은 Sigma. Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. SREBP-1 antibody, β-Actin antibody, AMPK antibody 및 horseradish peroxidase (HRP).conjugated goat anti.rabbit IgG는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. Phospho-AMPK antibody는 Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.

3. 세포 배양

실험에 사용된 HepG2 cell은 human hepatocellular carcinoma 세포주로서 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin 및 10% heat‐inactivated fetal bovine serum을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)을 이용하여, 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다.

4. 세포 생존율 (cell viability)의 측정

세포 생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 시행하였다. HepG2 Cell을 24‐well plate에 5 × 104 cells/well의 밀도로 투입하였다. 하루가 경과한 다음 적소두 에탄올 추출물 10, 50, 100, 500, 1000 μg/ml를 투약하고 다시 16시간 배양하였다. 이 때, vehicle로는 에탄올을 media에 대하여 0.2% (v/v) 농도로 처리하였다. 각 well에 MTT 500 μg/ml를 처리하고 4시간 뒤 MTT를 포함한 medium을 제거하였다. 세포들이 MTT를 환원하여 생성한 formazan crystal을 측정하기 위해, DMSO를 사용하여 용해한 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(background subtraction 630 nm).

5. 지방증 유도 및 측정

HepG2 cell에 지방증을 유도하기 위해 palmitate를 처리하였다. 1% bovine serum albumin을 함유한 DMEM을 배양액으로 사용하였으며, isopropanol을 용매로 50 mM 농도로 녹인 palmitate를 0.5 mM이 되도록 배양액에 투여하고 24 시간 배양하였다. 4% paraformaldehyde로 상온에서 15 분간 고정한 다음, PBS로 세척하고, Nile Red 100 ng/ml로 상온에서 5 분간 세포 내 중성 지방을 염색하였다. Olympus FV-1000 confocal laser scanning microscope (Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하고, Image J 1.48 software로 정량화하였다.

6. Western blot analysis

Protease inhibitor Cocktail (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 포함한 radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (50mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% sodium orthovanadate, 1% Triton X-100, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS)로 Total cell lysate를 추출하였다. NE-PER™ nuclear extraction kit (Thermo Scientific, IL, USA)로 nuclear protein은 추출하였다. Bradford assay로 단백량을 정량하고 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하였으며 Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 전사하였다. 5% skim milk를 포함한 Tris-buffered saline (TBS)로 상온에서 1 시간 blocking하였다. 각각의 specific primary antibody를 처리하고 4 ℃에서 하룻밤 반응시킨 다음 HRP가 결합되어 있는 2 차 항체와 상온에서 1 시간 반응시켰다. 각각의 단백질 band들을 SuperSignalⓇ chemiluminescence detection kit (Thermo Scientific, IL, USA)로 검출하였다.

7. semi-quantitative RT-PCR

Semi-quantitative RT-PCR로 lipogenesis 관련 유전자 발현을 측정하였다. RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 total RNA를 추출하고, M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 추출된 total RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다. TaqPCRx DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 각각의 primer(Bioneer)를 사용하여 합성된 cDNA를 증폭하였다. PCR 조건은 initial denaturation (95 ℃, 5 min)한 다음, denaturation (92 ℃, 30 sec), annealing (55 ℃, 40 sec), extension (72 ℃, 40 s) 및 final extension (72 ℃, 5 min) 하였다. LXRα는 denaturation, annealing 및 extension 과정을 28 cycles, SREBP-1c는 30 cycles, ACC는 25 cycles, FAS는 32 cycles, SCD-1은 22 cycles, GAPDH는 25 cycles 시행하였다. 증폭된 DNA를 1.2% agarose gel에 전기영동하고 ethidium bromide으로 염색 후 UV transilluminator로 band를 확인하였다. 각각의 primer는 다음과 같다(Table 1).

Table 1.Primer sequences used in RT-PCR

8. 통계 분석

통계에는 IBM SPSS statistics 21K (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 사용하였다. 그래프에서 각각의 측정값은 평균∂표준오차로 나타내었다. Student’s t-test와 One-way analysis of variance (ANOVA) test 로 그룹 간 평균을 비교하여, P＜0.05인 경우 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판단하였다.

 

결 과

1. 적소두 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향

적소두 추출물이 HepG2 cell에 대하여 독성을 나타내지 않는 농도 범위를 측정하기 위해 MTT assay를 시행하였다. HepG2 cell에 적소두 추출물을 10, 50, 100, 500, 1,000 μg/ml 농도로 처리하고 16시간 배양한 다음 MTT assay를 시행하였다. 적소두 추출물은 테스트한 모든 농도에서 세포 생존율을 통계적으로 의미있게 저하시키지 않았으며 (Fig. 1). 따라서 적소두 추출물은 1,000 μg/ml 이하의 농도에서는 HepG2 cell에 세포 독성을 유발하지 않는 것으로 판단하였다.

Fig. 1.Effect of ethanol extract of Seed of Phaseolus angularis (JSD) on cell viability. To measure cytotoxic effect of JSD on HepG2 cells, an MTT assay was conducted. The cells were treated with various concentration of JSD for 24h prior to MTT assay. Data are presented as the mean±SEM (n=3).

2. 적소두 추출물이 세포 내 지질 축적에 미치는 영향

Palmitate로 지방증을 유도한 HepG2 cell에 적소두 추출물을 투여하고 세포 내 지방량의 변화를 관찰하였다. Palmitate 0.5mM을 함유한 배지에서 HepG2 cell을 24 시간 배양하였다. 적소두 투여군에서는 마지막 16 시간 동안은 300 μg/ml의 농도로 적소두 추출물을 함께 처리하였다. 축적된 세포 내 지방을 Nile Red를 이용하여 염색하였다. Nile Red에 의해 지방이 붉은 색으로 염색되어 관찰되었으며, palmitate에 의해 세포 내 지방 축적이 증가하였고, 적소두 추출물을 함께 투여할 경우 지방 축적이 유의하게 억제됨을 확인하였다(Fig. 2).

Fig. 2.Effects of JSD on intracellular lipid accumulation in HepG2 cells. palmitate were administered to HepG2 cells for 24 h, with or without JSD during last 16h. After incubation, the cells were stained with Nile red. (A) Intracellular lipid droplets were viewed by fluorescencemicroscopy (original magnification ×400). (B) Cellular steatosis was quantified for each condition using four random low power fields of view. The fluorescence intensity was expressed as the means ± SEM (n=3). *P＜0.05, compared to palmitate treated cells.

3. 적소두 추출물이 LXRα, SREBP-1c에 미치는 영향

SREBP-1c는 lipogenesis를 조절하는 주요 전사 인자로서23), 주로 LXRα에 의해 발현이 유도된다24). 본 실험에서는 LXRα agonist인 T0901317로 LXRα 및 SREBP-1c의 발현을 유도하였고, 적소두 추출물 투여 시 LXRα 와 SREBP-1c의 변화를 관찰하였다. HepG2 cell에 T0901317 10μM을 처리하여 24시간 배양하였으며, 적소두 투여군에는 마지막 16 시간 동안 적소두 추출물 100, 300μg/ml를 배지에 함께 투여하였다. T0901317에 의해 LXRα mRNA의 발현이 증가되었으며, 아울러 SREBP-1c mRNA 및 protein의 발현이 유도되었다. 함께 투여된 적소두 추출물은 T0901317에 의해 증가된 LXRα mRNA를 뚜렷하게 감소시켰으며, 결과적으로 SREBP-1c mRNA 및 protein을 유의하게 감소시켰다(Fig. 3).

Fig. 3.Effect of JSD on LXRα mediated SREBP-1c expression in HepG2 cells. The effect of JSD on the expression level of LXRα mRNA (A), and SREBP-1c protein and mRNA (B). The intensity of each PCR band was measured by densitomeric analysis (ImageJ), and relative expression of each gene was calculated over GAPDH. Data are presented as the mean∂SEM (n=3). *P＜0.05, compared to palmitate treated cells.

4. 적소두 추출물이 ACC, FAS, SCD-1에 미치는 영향

ACC, FAS, SCD-1는 중성 지방의 합성에 관여하는 효소들로서 SREBP-1c에 의해 발현이 조절되며, HepG2 cell에 T0901317을 처리하면 SREBP-1c protein의 증가로 인하여 ACC, FAS, SCD-1 mRNA 또한 증가한다. 위에서 기술한 것과 동일한 조건으로 T0901317과 적소두 추출물을 처리하고 HepG2 cell을 배양하였다. 적소두 추출물을 함께 투여할 경우 T0901317에 의해 증가한 ACC, FAS, SCD-1 mRNA level이 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 4).

Fig. 4.Effect of JSD on expression of lipogenic genes in HepG2 cells. Expression of lipogenic genes were determined by semi-quantitative RT-PCR (A), and relative mRNA levels of ACC (B), FAS (C), SCD-1 (D) was represented on each bar graph. Data are presented as the mean±SEM (n=3). *P＜0.05, compared to palmitate treated cells.

5. 적소두 추출물이 AMPK 활성화에 미치는 영향

AMP-activated protein kinase (AMPK)는 phosphorylation되면 활성화되어 SREBP-1c의 발현을 감소시키며, AMPK를 활성화시키는 metformin이 동물 모델에서 간 내 지방증을 완화시키는 사실이 확인되었다25,26). 적소두 추출물이 AMPK 활성화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 HepG2 cell에 적소두 추출물 100, 300 μg/ml를 투여하고 16 시간 배양한 다음, AMPK 및 phospho-AMPK의 변화를 western blot으로 측정하였다. 양성대조군에는 metformin 2mM을 처리하였다. 적소두 추출물은 metformin처럼 phospho-AMPK protein level을 뚜렷하게 증가시켰다(Fig. 5).

Fig. 5.Effect of JSD on AMPK activation in HepG2 cells. JSD was administered to HepG2 cells for 16 h, and metformin was used as a positive control. AMPK and phospho-Thr-172 AMPK (an active form of AMPK) were measured by wetern blot analysis. Actin was measured as an internal control.

 

고 찰

비알코올성 지방간 질환의 치료를 위해서는 기본적으로 체중 조절과 운동이 요구되며, 약물 요법에서는 insulin sensitizing agents, lipid lowering agents, antioxidants, TNF-α antagonist, farsenoid X receptor agonist 그 외에 ursodeoxycholic acid, taurine, omega-3 fatty acids 등 매우 다양한 약물들의 임상적 효능이 평가되어지고 있으나, 아직 표준 치료로 인정된 치료제는 없다2,6). 따라서 기존 치료제에 대한 평가와 함께 새로운 치료제의 발굴이 매우 필요한 상황이다. 한약은 천연물에서 기원하고, 오랜 임상 경험을 가지고 있으며, 최근 다양한 한약들이 동물 실험과 임상 연구를 통해 간효소치를 감소시키고 지방간증을 완화시키는 것으로 확인되어 지고 있다27). 따라서 한약의 작용 기전에 대한 추가적인 연구는 안전한 치료제로서의 한약의 적용 확대 뿐 아니라 장기적으로 새로운 치료제 개발에도 도움이 될 것으로 생각된다.

적소두(赤小豆)는 팥 Phaseolus angularis Wight의 씨를 말하며7), 전통 한의학에서 오래 기간 비만 치료를 위해 사용되어온 한약재의 하나이다8). 최근 연구에서는 당뇨와13) 고콜레스테롤혈증15)에 대해서도 효능이 있음이 확인되었다. 비만, 고지혈증 및 인슐린 저항성 등은 비알코올성 지방간 질환의 주요 병리 인자들이다2). 따라서, 전통의학에서 비만을 치료하는데 사용되어져 왔고, 실험적으로 당뇨를 개선시키는 효능이 확인된 적소두는 지방간을 개선시킬 가능성이 높을 것으로 생각되었다. 본 연구에서는 지방산의 하나인 palmitate를 HepG2 cell에 처리하여 세포 내 지질 축적을 유발하였고, 적소두 추출물을 투여하며 세포 내 지질량의 변화를 관찰하였다. 적소두 추출물을 함께 투여한 경우 palmitate에 의해 증가한 세포 내 지방량이 통계적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.

SREBP-1c는 간에서 지질을 합성하는 유전자들을 조절하는 주요 전사 인자이다. SREBP-1c가 증가되면 ACC, FAS, 및 SCD-1과 같은 유전자들의 발현이 유도되어 간 내 지방 합성이 촉진된다21). LXRα는 산화된 콜레스테롤 부산물에 결합하는 핵수용체로 세포 내에 산화스테롤(oxysterol)이 증가하면 말초 조직에서 간으로 콜레스테롤을 운반하는 단백의 유전자들을 활성화시키고, 간 내에서는 지방산과 중성지방의 합성이 증가되도록 SREBP-1c의 발현을 유도한다28,29). 본 실험에서는 LXRα 활성제인 T0901317을 HepG2 cell에 처리하여, 전사 인자 SREBP-1c를 증가시킴으로써, ACC, FAS, SCD-1의 발현을 유도하였다. 적소두 추출물이 이러한 간내 지질 대사 관련 유전자들에 미치는 영향을 조사하기 위해 T0901317과 함께 적소두 추출물을 처리하였으며, 적소두 추출물이 함께 투여된 경우에는 이 유전자들의 발현이 모두 감소하는 것이 관찰되었다. 따라서, 적소두 추출물이 간 내 지질 축적을 완화시키는 작용은 지질 합성 억제 작용을 통해 이루어질 가능성이 높다고 판단된다.

한편, AMPK는 세포 내 에너지 상태를 감지하여 에너지 균형을 유지시키는 역할을 담당하며, 간을 포함한 전신 지질 대사를 조절하는 역할을 담당한다30,31). 세포 내 에너지가 저하되면 ATP 생산을 증가시키기 위해 이화 작용을 촉진시키고, 동화 작용을 억제시킨다. 간 내에서는 AMPK가 활성화되면, lipogenesis에 관여하는 주요 전사 인자들인 SREBP-1c 발현을 감소시키고 carbohydrate responsive element-binding protein (ChREBP)를 불활성화시켜, 지방산의 합성이 감소하게 된다25,32,33). 또한, ACC를 불활성화시켜 지방산 합성을 감소시키고34), sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT)를 불활성화하여 중성 지방의 합성을 감소시키며35), 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase)를 불활성화하여 콜레스테롤의 합성을 감소시킨다36). AMPK는 이와 같이 간 내 지질 대사에 중요한 역할을 담당하고 있으며, 따라서 지방간 질환의 주요 therapeutic target으로 판단되어지고 있다19). 본 연구에서는 적소두 추출물의 anti-lipogenic effect가 AMPK에 의해 매개되는지를 확인해보기 위해, HepG2 cell에 적소두 추출물을 투여하고 AMPK 및 AMPK의 active form인 phospho-AMPK의 변화를 관찰하였다. 그 결과 적소두 추출물은 AMPK 단백을 증가시키지는 않았으나, active form인 phospho-AMPK 단백을 증가시키는 것이 확인되었으며, 따라서 적소두 추출물의 anti-lipogenic effect는 최소한 부분적으로 AMPK를 활성화시킴으로서 나타나는 것으로 판단할 수 있다.

 

결 론

이상의 결과를 요약하면, 본 연구에서는 HepG2 cell에서 유도된 비알코올성 지방간 세포 모델에서 적소두 추출물의 anti-lipogenic effect를 확인하였다. 이는 최소한 부분적으로 AMPK 활성화를 통해, LXRα/SREBP-1c pathway를 통한 lipogenic enzymes의 발현을 억제함으로써 이루어지는 것으로 생각된다. 이러한 연구 결과는 비만 치료에 적소두를 사용하는 것에 대한 과학적 근거로 활용될 수 있으며, 향후 추가적인 연구가 진행된다면 비알코올성 지방간질환의 새로운 한방 치료제로도 활용될 수 있을 것으로 생각된다.