• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권3호
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• pp.209-212
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• 1986

YEp 13 plasmid에 B. amyloliquefaciens의 $\alpha$-amylase gene을 cloning시켜서 얻은 hybrid plasmid를 E. coli C 600으로 형질전환시켜서 amylase 활성을 나타내는 균주를 선별하였다. 선별된 E. coli C 600균주를 plasmid추출하여 전기영동해 본 결과 plasmid가 매우 불안정하였으며, 그중 가장 단순한 plasmid band를 지니고 있으며 amylase활성이 강한 E. coli균주를 선별하였다. 선별된 균주의 균체내에 있는 2개의 plasmid DNA를 분리하여 각각의 plasmid를 pTG 17-1, pTG 17-2로 명명하였으며 S. cerevisiae MC 16에서 형질전환이 가능한 pTG 17-2 DNA를 제한효소 EcoRI과 Pst I으로 restriction한 결과 EcoRI으로 처리한 경우는 7.3, 4.8, 2.4 kb인 3개의 분획으로 나타났으며 Pst I으로 처리한 경우는 linear로 14.5kb임을 알았으며 이로써 pTG 17-2 plasmid의 size가 약 14kb임을 알았다. 또한 E.coli균체내에서의 ampicillin sensitive로써 이 plasmid의 ampicillin resistance site가 결실되었음을 알았고 효모의 형진전환체로 부터의 $\alpha$-amylase는 균체외로 분비되지 않았고 효모균체내의 $\alpha$-amylase는 Somogyi-Nelson방법과 Agar diffusion 방법으로 확인하였다.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제15권8호
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• pp.5412-5418
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• 2014

참돔 이리도바이러스(RSIV)는 이리도바이러스과에 속하며, 많은 아시아 국가에서 감염성 어류 질병을 유발하여 양식산업에 커다란 경제적 손실을 입히는 바이러스이다. 우리는 최근에 효모표면발현(yeast surface display, YSD)를 사용하여 다양한 해양바이러스를 동정하고 검출할 수 있는 새로운 실험시스템을 개발하였다. 이 연구에서 우리는 참돔 이리도 바이러스(RSIV)의 외피단백질을 효모표면 발현 기법을 이용하여 발현시켰다. 바이러스 외피단백질 유전자는 염기서열 데이터베이스에 기초하여 합성되었고, 효모발현벡터인 pCTCON2으로 서브클로닝되었다. 이 벡터는 효모 strain EBY100으로 형질전환 되었다. Flow cytometry와 Western blot analysis를 통해 RSIV 외피단백질의 발현을 확인하였다. ${\beta}$-mercaptoethanol 처리에 의해 발현된 바이러스 외피단백질을 효모 표면로부터 분리하였다. 이 연구의 결과는 YSD 시스템이 해양바이러스 외피단백질을 획득하기 위한 매우 좋은 발현시스템이라는 것을 보여준다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제4권1호
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• pp.7-12
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• 1994

A yeast strain secreting glucoamylase was transformed with an expression vector (pMS12) containing the promoter of yeast alcohol dehydrogenase I gene ADC1, mouse salivary $\alpha$-amylase cDNA, and a segment of yeast $21\mu m$ plasmid. The transformed strain could produce ethanol from starch (4%, w/v) through a direct one-step process with the conversion efficiency of 93.2%, during 5 days of fermentation, while the original, untransformed strain exhibited a conversion efficiency of 38.1% under the same condition. When the regulatory site of the ADC1 promoter region was removed, the production of ethanol increased to 29~37% in the presence of exogenous 3%(v/v) ethanol in the fermentation medium.

• 미생물학회지
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• 제41권4호
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• pp.275-280
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• 2005

Bacillus anthracis는 탄저병의 병원체이다. 탄저병의 독소는 Bacillus anthracis가 가진 세가지 독소로 이루어져 있다. protective antigen (PA), lethal factor (LF)그리고 edema factor (EF)로 구성되어 있다. PA는 세포수용체와 결합하여 활성화 과정을 거친 후 LF 흑은 EF를 세포질 안으로 이동시켜 주는 역할을 한다. LF는 금속이온 $(Zn^{2+})$ 의존적 단백질 가수분해 효소로써 탄저병에 감염된 동물들의 치사독소로 작용하게 된다. 따라서 LF에 대한 특성 분석 및 억제재 개발에 관한 연구는 탄저치료제 개발에 매우 중요한 과정이라 할 수 있다. 본 연구에서는 탄저독소의 치료제 개발을 위해 선행되어야 하는 LF 고처리량 활성검증방법 및 저해제 선별에 더 높은 효율을 가지기 위해 이러한 시스템 방법 등을 이용하여 세포내 검정방법의 기초 자료를 마련하고자 하였다. 이를 위하여 yeast를 숙주로 한 LF 발현 vector의 구축과, 구축한 발현 시스템을 yeast에 형질전환 하여 plasmid의 안정성 및 LF유전자의 발현을 확인하였다. 본 연구는 LF유전자의 발현을 진핵세포 내에서 처음으로 시도했으며, 세포내 검증 시스템 도입의 기초적 자료를 제공하였다. Yeast내에서의 LF의 발현은 탄저병의 저해제 선별이나 활성측정검증을 생체 내에서 용이하게 할 수 있다는 가능성을 나타냈다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권3호
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• pp.221-226
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• 2008

효모에서 사람의 H-, L-ferritin을 생산하기 위해서, 기존에 복제된 vector를 사용하였으며,단백질을 발현하기 위해서 각각의 증폭된 ferritin 유전자를 GALI promoter에 의해 조절되는 pYES2.1/V5-His-TOPO 효모 발현 vector에 삽입하였다. Western blot 분석을 통해서 사람의 H-, L-ferritin subunits을 함유한 재조합 효모에서 사람의 ferritin이 발현된 것을 확인할 수 있었다. 또한 Atomic absorption spectrometry(AAS) 분석을 통해서 형질변환된 효모의 철 함유량이 대조군과 비교하여 $1.6{\sim}l.8$배 증가한 것을 확인하였다. 향후 ferritin이 함유된 형질변환 효모를 사용하여 잠재적으로 철이 강화된 영양성분을 기능성 식품과 사료에 이용할 수 있을 것이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제1권1호
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• pp.31-36
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• 1991

Yeast expression plasmids containing an appropriate leader sequence and bovine $\beta$-casein cDNA were constructed to produce $\beta$-casein for the study of its functional characteristics. Two kinds of expression systems for $\beta$-casein were constructed using pCGYl444 as a precursor plasmid. This plasmid is a yeast-E. coli shuttle vector which contains the chelatin promoter. The plasmid pISB202 contains the invertase leader sequence and $\beta$-casein gene. The plasmid pDEB303 contains the original bovine $\beta$-casein leader sequence gene. These two plasmids were introduced into S. cerevisiae AB116 which is a strain deficient in the major yeast proteinases. Each clone was grown in minimal media for 24 h before induction by $CuSO_4$. The cells were thus grown under expression conditions. Both strains harbouring pISB202 and pDEB303 expressed bovine $\beta$-casein. The $\beta$-casein was detected using immunochemical staining after western blot. Secretion of $\beta$-casein was detected in the culture broth. The estimated amount of secreted $\beta$-casein was approximately 50 ${\MU}g$/l.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권4호
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• pp.348-355
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• 1991

Bacillus subtilis의 Beta-1,4-glucanase 유전자와 Saccharomyces cerevisiae의 alcohol dehydrogenase isoenzyme I 유전자 (ADHI)의 promoter와 mouse $\alpha$-amylase의 분비신호를 연결하여 분비형 플라스미드를 구성하였으며 이를 산업용 알콜생산 효모인 Saccharomyces cerevisiae 54에 도입하여 형질전환시켰다. 한편 $\beta$-glucanase 유전자의 발현정도를 증대시키기 위해 CYC1 유전자의 전사종결신호를 부가한 후 역시 Saccharomyces cerevisiae 54에 도입하였다. 형질전체들은 carboxymethyl cellulose가 함유된 평판배지에서 $\beta$-glucanase를 분비하고 있음을 확인할 수 있었다. 전사종결 신호가 부가된 경우엔 전체역가가 2배 정도 증가하였다. 형질전환체들이 세포밖으로 분비한 효소역가는 전체의 60 정도였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제9권5호
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• pp.668-671
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• 1999

The gene encoding Schwanniomyces occidentalis $\alpha-amylase$(AMY) was introduced into Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus which secreted only glucoamylase, by using a linearized yeast integrating vector to develop stable strains with a capability of secreting $\alpha-amylase$and glucoamylase simultaneously. A dominant selectable marker, the geneticin(G418) resistance gene (Gt^r$), was cloned into a vector to screen wild-type diploid transformants harboring the AMY gene. The amylolytic activities of transformants were about 3-7 times higher than those of the recipient strains. When grown in nonselective media, the transformants with the linearized integrating vector containing the AMY gene exhibited almost all of the mitotic stability after 100 generations.

• Journal of Life Science
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• 제12권2호
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• pp.53-56
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• 2002

The baculovirus expression vector system (BEVS) is one of the powerful heterologous protein expression systems using insect cells. As a result this has become a hot issue in the fleld of biotechnology. The advantage of the BEVS is that the large-scale production of heterologous proteins, which undergo posttranslational modification in the endoplasmic reticulum (ER), can be accomplished. Altrough posttranslational modification of heterologous proteins in insect cells is more similar to mammalian cells than yeast, it is not always identical. Therefore, aggregation and degradation can sometimes occur in the ER. To produce a high level of bioactive heterologous proteins using BEVS in insect cells, the prerequisite is to completely understand the posttranslational conditions that determine how newly synthesized polypeptides are folded and assembling with ER chaperones in the ER lumen. Here, we provide information on current BEVS problems and the possibility of successful heterologous protein production from mammalian cells.

• BMB Reports
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• 제31권1호
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• pp.77-82
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• 1998

To purify the geranylgeranyl protein transferase type I (GGPT-I) efficiently, a gene expression system using the pGEX-4T-1 vector was constructed. The cal1 gene, encoding the ${\beta}$ subunit of GGPT-I, was subcloned into the pGEX-4T-1 vector and co-transformed into E. coli cells harboring the ram2 gene, the ${\alpha}$ subunit gene of GGPT-I. GGPT-I was highly expressed as a fusion protein with glutathione S-transferase (GST) in E. coli, purified to homogeneity by glutathione-agarose affinity chromatography, and the GST moiety was excised by thrombin treatment. The purified yeast GGPT-I showed a dose-dependent increase in the transferase activity, and its apparent $K_m$ value for an undecapeptide fused with GST (GST-PEP) was $0.66\;{\mu}M$ and the apparent value for geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) was $0.071\;{\mu}M$.