Pseudomonas sp. S-47은 xylXYZLTE 유전자에 의하여 암호화되는 효소군에 의하여 4CBA를 분해하여 5-chloro-2-hydroxymuconic semialdehyde(5C-2HMS)를 생성하는데, 본 연구에서는 이 5C-2HMS의 다음 분해과정을 확인하였다. xylXYZLTE 유전자와 5-chloro-2-hydroxymuconic semialdehyde dehydrogenase(5C-2HMSD)를 암호화하고 xylG 유전자를 포함하는 재조합 균주인 pCSS202로부터, xylG 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pENV5를 만들었다. 이 플라스미드는 2-hydroxymuconic semialdehyde, 3-chloro-muconate, 2-hydroxy-6-oxohepta-2,4-dienoate, 2-hydroxy-5-methylmuconic semialdehyde와 같은 aromatic compound 에서 분해능을 나타냈으며, 그 중 5C-2HMS에서 가장 높은 분해능을 나타내었다. 또한 5C-2HMSD를 암호화하는 유전자인 xylC의 염기서열을 분석한 결과, 약 1,600 bp의 염기와 486개의 amino acid residue를 갖고있는 것을 확인하였다. P. sp. S-47의 xylG 유전자를 비교 분석한 결과 P. putida CF600, P. putida G7과 P. putida mt-2 등의 5C-2HMS dehydro-genase와 85% 이상의 amino acid homology를 보여주었다.
A xylanase-producing Trichoderma strain was isolated from soil. Xylanase from Trichoderma strain SY was purified 21-fold to an apparent homogeneity, with a $17.4\%$ yield. The optimum pH and temperature were determined to be 5.5 and $50^{\circ}C$, respectively, and its molecular weight was 21-kDa by SDS-PAGE. The corresponding gene, named xyl, was cloned by RT-PCR. DNA blot analysis of xyl showed that this gene is present as a single copy. The amino acid sequence of the Xyl protein showed similarity to those of other xylanases derived from various fungi. mRNA of xyl was highly expressed when this fungus was grown on cellulose or xylan as a sole carbon source, but undetectable when grown on sucrose. Extracts of Escherichia coli cells expressing xyl were found to have xylanase activity. It was confirmed that xyl from this isolate encodes xylanase.
Two endoxylanases from an alkaliphilic bacterium, Bacillus halodurans C-1, were purified 3.8- and 7.9- fold with specific activities of 9.4 and 19.8U/mg protein, respectively. The molecular masses of both purified enzymes were 23 and 47 kDa, respectively, and 23 kDa xylanase I (Xyl I) exhibited an optimum pH at 7.0, whereas 47 kDa xylanase II (Xyl II) showed a broad pH range of 5.0 to 9.0. The temperature optima of both xylanases were $60^{\circ}C\;and\;70^{\circ}C$, respectively. Both were stable in the pH range of 6.0 to 9.0 and 5.0 to 10.0, respectively, and they were stable up to $60^{\circ}C\;and\;70^{\circ}C$, respectively. The $K_m\;and\;V_{max}$ of Xyl I were 4.33mg/ml and $63.5{\mu}mol/min/mg$, respectively, whereas Xyl II had a $K_m$ value of 0.30 mg/ml and $V_{max}$ of $210{\mu}mol/min/mg$. Both xylanases hydrolyzed xylans from birchwood, oat spelt, and larchwood. However, they showed different modes of action; a series of xylooligosaccharides larger than xylotriose were released as the major products by Xyl I, whereas xylobiose and xylotriose were the main products by Xyl II. The maximum synergistic action of the two enzymes on hydrolysis of xylan was 2.16 with the ratio of Xyl I to Xyl II at 1:9.
자일란(xylan)을 가수 분해할 수 있는 해양 미생물 PX-1을 제주도 연안의 해수 로부터 순수하게 분리하였다. 16S rRNA 유전자 서열 및 생화학적 분류 결과에 기초하여, PX-1은 Aestuariibacter 속의 한 종으로 확인되어 Aestuariibacter sp. PX-1로 명명하였다. PX-1을 액체 배양한 배양액으로부터 암모늄 설페이트 침전법과 불용성 자일란을 이용한 흡착 크로마토그래피 방법을 이용하여, 세포 외로 분비된 자일라네이즈 후보 단백질을 순수하게 정제하였다. 정제한 후보 자일라네이즈 단백질(XylA)은 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis 및 겔여과 크로마토그래피 분석결과, 분자량이 대략 64 kDa인 것으로 추정되었다. XylA는 실제로 beechwood xylan 을 가수분해하는 자일라네이즈 활성을 보였으며, pH 6.0과 45℃에서 최대의 효소 활성을 나타냈다. XylA에 의한 자일란 가수 분해산물을 TLC로 분석한 결과, XylA 는 자일란을 자일로스와 자일로올리고당으로 분해하는 endo-type의 자일라네이즈임을 확인하였다. Beechwood xylan 에 대한 XylA의 Km 및 Vmax 값은 각각 27.78 mM (4.17 mg/ml), 78.13 μM/min이었다.
세균인 Paenibacillus sp. DG-22의 유전체 DNA library가 제조되었으며, ${\beta}-xylosidase-$양성 클론이 형광기질인 $4-methylumbelliferyl-{\beta}-D-xylopyranoside$$({\beta}MUX)$를 사용하여 확인되었다. 이 클론으로부터 재조합 플라스미드가 분리되었고 삽입된 4.3-kb 크기 DNA의 염기서열이 결정되었다. ${beta}-xylosidase$ 유전자는 분자량이 78.710 dal-ton이고 pI가 5.0인 701개의 아미노산을 암호화하는 2,106 염기쌍의 열린해독틀(ORF)로 구성되어있었다. xylA 유전자산물의 추론된 아미노산 서열은 과(family) 52에 속하는 클리코실 가수분해효소로 분류된 ${beta}-xylosidase$들과 상당한 유사성을 가지고 있었다. 이 xylA 유전자에 6개의 히스티딘-꼬리표를 붙이기 위해 pQE60 발현벡터에 다시 클로닝하였다. 재조합 ${beta}-xylosidase$$(XylA-H_6)$가 열처리와 고정화금속친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 순수하게 정제되었다. $XylA-H_6$ 효소의 최적 pH와 온도는 각각 pH 5.5-6.0과 $60^{\circ}C$이었다.
The neucleotide sequences of the xylA gene encoding $\beta $-xylosidase of Bacillus stearothermophilus and is its flanking regions were datermined. Three open reading frame(ORFs) were found, one of which(ORF1) appeared to code for the $\beta $-xylosidase. The 1830 base pair ORF1 encoded 609 amino acids starting from a TTG initiation codon. The molecular weight deduced from the nucleotide sequence(68 KD) was in agreement with that estimated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the purified enzyme(66 KD). The Shine-Dalgarno sequence(5'-AGGAGG-3') was found 11 bp upstream of the initiation codon. Further 15 bp upstream, there observed a potential transcription initiation signals. The putative -10 sequence(CATAAT) and -35 sequence(TTGTTA) coresponded closely to the consensus sequences for Bacillus subtilis RNA polymerase with major sigma factor. The guanine-plus-cytosine content of the coding region of the xylA gene was 56mol% while that of the third position of the codons was 63 mol%. Based on the comparison with the amino acid sequences of several other carbohydrate degrading enzymes, two conserved regions, possibly participating in the catalytic mechamism of $\beta $-xylosidase xylA, were identified in 278-298 and 329-350 regions of the translated xylA gene. The nucleotide sequence of the xylA was found to exhibit no homology to any other genes so far reproted.
Streptomyces chibaensis J-59 did not grow in the culture medium containing only xylose or xylan as a carbon source, because it was defective in xylulokinase production; xylB mutant. S. chibaensis J-59 was able to produce xylanase and $\beta $-xylosidase as well as glucose isomerase. The glucose isomerase in S. chilbaensis J-59 was induced in the medium containing xylan or xylose which could be utilized as an inducer but not sa carbon and energy sources. So we tried to produce glucose isomerase whthout consumption of xylose or xylan as an inducer by using xylB mutant S. chilbaensis J-59. The optimum condition for the production of the glucose isomerase was attained in a culture medium composed of 1% xylan, 0.15% glucose, 1.5% corn steep liquor, 0.1% MaSO$_{4}$ $\CDOT $7H$_{2}$O, and 0.012% CoCL$_{2}$ $\CDOT $ 6H$_{2}$O(pH 7.0). The production of the enzyme reached to a maximum level when the bacteria were cultured for 42 h at 30$\circ $C. The enzyme production in a jar fermentor was increased twice as much as that in a flask culture.
Kim, Hyeri;Guevarra, Robin B.;Cho, Jae Hyoung;Kim, Hyeun Bum;Lee, Ju-Hoon
Journal of Animal Science and Technology
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제63권1호
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pp.191-193
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2021
Lactococcus lactis is a fermentative lactic acid bacterium that is used extensively in food fermentations. The L. lactis strain K_LL005 was isolated from the grasshopper (Oxya chinensis sinuosa) gut in Korea. In this study, we reported the complete genome sequence of Lactococcus lactis K_LL005. The final complete genome assembly consist of one circular chromosome (2,375,093 bp) with an overall guanine + cytosine (G + C) content of 35.0%. Annotation results revealed 2,281 protein-coding sequences (CDSs), 19 rRNAs, and 68 tRNA genes. Lactococcus lactis K_LL005 has a gene encoding xylose metabolism such as xylR, xylA, and xylB (xylRAB).
발효 김치의 보존성과 품질 향상을 위하여 천연의 항 미생물활성물질인 자일리톨(Xyl)과 자몽씨추출물(GSE) 첨가 효과를 조사하였다. 자일리톨 첨가량은 0, 1, 2%(w/w)와 자몽씨추출물 0.1%(w/w)로 하여 6가지 실험처리구(Control, A; 1% Xyl, B; 2% Xyl, C; 0.1% GSE, D; 0.1% GSE+1% Xyl, E; 0.1% GSE+2% Xyl)로 $10^{\circ}C$에서 25일동안 발효시키면서 관능적, 이화학적 및 미생물학적 특성을 보았다. 관능평가 결과 기호특성에서 조직감, 신맛, 전반적인 기호도에서 자몽씨추출물 0.1%에 2% 자일리톨을 혼합한 처리구 E가 높은 점수를 받았고, 강도특성에서 냄새와 신맛은 대조구가 높은 점수를 받았고, 조직감은 자몽씨추출물과 자일리톨 2%가 혼합된 처리구 E가 높은 점수를 받았다. pH는 점차로 낮아졌는데, 대조구가 가장 낮은 pH를 보였고, 처리구 E가 발효말기까지 높은 pH를 나타냈다. 전체 발효기간 동안 적정산도, 총균수와 젖산균수는 대조구에 비해서 자몽씨추출물 0.1%와 자일리톨 2%을 함유하는 처리구 E에서 현저히 적었다. 연구결과 자몽씨추출물 0.1%에 자일리톨 2%가 첨가된 처리구 E가 발효숙성을 조절하여 맛과 조직감을 향상시키고, 가식기간을 약 2배정도 연장시키는 것으로 나타났다.
Xylan 분해 균주인 Bacillus stearothermophilus No. 236 분리균의 $\beta$-xylosidase 생산 유전자(xylA)의 염기 서열 및 transcription start site를 결정한 이전 연구 결과에 의하면 xylA 유전자는 매우 특이하게 UUG codon에서 translation이 시작되며 initiation codon 15dp 윗쪽에는 promoter로 추정되는 염기 서열을 가지고 있는 것으로 분석되었다. 이와 같은 xylA 유전자 promoter region의 구조는 E. coli에 클로닝된 xalA 유전자를 이용한 실험 결과로도 확인되었다. xalA promoter의 -10 element는 CATAAT로서 6개의 염기 중 5개가 그리고 -35 element의 경우는 TTGTTA로서 6개의 염기 중 4개가 consensus sequence와 일치되었으나 두 hexamer 사이의 거리가 최적 거리에서 크게 벗어난 12 bp인 것으로 분석되었다. 본 연구에서는 $\beta$-xylosidase의 대량 생산을 위한 연구의 일환으로 xalA promoter sequence의 체계적 구조 변화에 의한 promoter strength에 미치는 효과를 E. coli와 B. subtilis두 숙주 세포에서 조사 분석해 본 결과, 첫째로 두 promoter elements사이의 거리를 최적거리인 17 bp로 바꾸었을 때 xalA의 발현율은 E. coli에서는 1.6배, B. subtilis에서는 2.5배 정도 증가함을 보여주었다. 그리고 -35 element는 consensus sequence와 같이 5'쪽에서 네번째 위치에 있는 T$\longrightarrow$A로 변이 시켰을 때 E. coli경우 2.3배, 특히 B. subtilis에서는 35배나 되는 가장 높은 promoter 활성의 증가를 보였다. 그러나 -10 sequence의 경우 consensus sequence와 같이 5' 쪽에서 첫번째 위치에 있는 C$\longrightarrow$T로 transition시켰을 때 예상외로 오히려 발현율이 5~15배까지 낮아지는 특이한 결과를 얻었다. 따라서 본 연구 결과 xalA promoter의 경우 -10 sequence인 CATAAT의 C와 -35 element의 두 염기가 promoter활성에 있어 가장 중요한 염기임을 알 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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