Strength of the Mutant Promoters for the \beta-xylosidase gene of Bacillus stearothermophilus No. 236

The xylA gene of Bacillus stearothermophilus No. 236 encoding $\beta$-xylosidase was cloned and sequenced previously. The transcriptional start site of the xylA gene cloned in E. coli was identified to be the guanine (G) by primer extension analysis. This supports that the expression of xylA gene is also directed in the E. coli cells by the previously determined transcription initiation signals, -10 sequence (CATAAT) and -35 sequence (TTGTTA) separated by 12 bp. To increase the expression of $\beta$-xylosidase, firstly the spacer region of xylA promoter was extended from 12 to 17 bp, and then the -10 and -35 elements were converted into their respective consensus sequences. The mutant promoters thus obtained were tested for their activities in both the E. coli and B. subtilis host cells. The change of the length of the spacer region from 12 to 17 bp resulted in a 1.6- and 2.5-fold increase in promoter strength in comparison with the wild type promoter in E. coli and B. subtilis cells, respectively. Also, strength of the promoter with the fourth T to A transversion on its -35 element increased in the transcription level by about 35 times compared with that of wild-type promoter. However, surprisingly the 5' end C-to-T transition of the -10 hexamer showed a 5- to 15-fold reduction in $\beta$-xylosidase activity in both E. coli and B. subtilis. Together, the present data demonstrated that the 5' end nucleotide C of the -10 sequence CATAAT and the fourth nucleotide A of the -35 hexamer are two most critical nucleotides for the promoter activity in the context of the xylA promoter.

Bacillus stearothermophilus No. 236 \beta-xylosidase 유전자 변이 Promoter의 Strength분석

Xylan 분해 균주인 Bacillus stearothermophilus No. 236 분리균의 $\beta$-xylosidase 생산 유전자(xylA)의 염기 서열 및 transcription start site를 결정한 이전 연구 결과에 의하면 xylA 유전자는 매우 특이하게 UUG codon에서 translation이 시작되며 initiation codon 15dp 윗쪽에는 promoter로 추정되는 염기 서열을 가지고 있는 것으로 분석되었다. 이와 같은 xylA 유전자 promoter region의 구조는 E. coli에 클로닝된 xalA 유전자를 이용한 실험 결과로도 확인되었다. xalA promoter의 -10 element는 CATAAT로서 6개의 염기 중 5개가 그리고 -35 element의 경우는 TTGTTA로서 6개의 염기 중 4개가 consensus sequence와 일치되었으나 두 hexamer 사이의 거리가 최적 거리에서 크게 벗어난 12 bp인 것으로 분석되었다. 본 연구에서는 $\beta$-xylosidase의 대량 생산을 위한 연구의 일환으로 xalA promoter sequence의 체계적 구조 변화에 의한 promoter strength에 미치는 효과를 E. coli와 B. subtilis두 숙주 세포에서 조사 분석해 본 결과, 첫째로 두 promoter elements사이의 거리를 최적거리인 17 bp로 바꾸었을 때 xalA의 발현율은 E. coli에서는 1.6배, B. subtilis에서는 2.5배 정도 증가함을 보여주었다. 그리고 -35 element는 consensus sequence와 같이 5'쪽에서 네번째 위치에 있는 T$\longrightarrow$A로 변이 시켰을 때 E. coli경우 2.3배, 특히 B. subtilis에서는 35배나 되는 가장 높은 promoter 활성의 증가를 보였다. 그러나 -10 sequence의 경우 consensus sequence와 같이 5' 쪽에서 첫번째 위치에 있는 C$\longrightarrow$T로 transition시켰을 때 예상외로 오히려 발현율이 5~15배까지 낮아지는 특이한 결과를 얻었다. 따라서 본 연구 결과 xalA promoter의 경우 -10 sequence인 CATAAT의 C와 -35 element의 두 염기가 promoter활성에 있어 가장 중요한 염기임을 알 수 있었다.