• 한국수정란이식학회지
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• 제32권3호
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• pp.73-79
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• 2017

Transplantation is considered to be a very useful approach to improve human welfare and to prolong life-span. Heterologous organ transplantation using pig organs which are similar to human beings and easy to make mass-production has known as one of the alternatives. To ensure potential usage of the pig organ for transplantation application, it is essentially required to generate transgenic pig modifying immuno-related genes. Previously, we reported production of heterozygous ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase (GalT) knock-out and human membrane cofactor protein (MCP) expressing pig ($GalT^{-MCP/+}$), which is enforced for suppression of hyperacute and acute immunological rejection. In this study, we reported generation of homozygous pig ($GalT^{-MCP/-MCP}$) by crossbreeding $GalT^{-MCP/+}$ pigs. Two female founders gave birth to six of $GalT^{-MCP/-MCP}$, and seven $GalT^{-MCP/+}$ pigs. We performed quantitative real-time PCR, western blot, and flow cytometry analyses to confirm GalT and MCP expression. We showed that fibroblasts of the $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig do not express GalT and its product Gal antigen, while efficiently express MCP. We also showed no expression of GalT, otherwise expression of MCP at heart, kidney, liver and pancreas of transgenic pig. Taken together, we suggest that the $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig is a useful candidate to apply xenotransplantation study.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.39-39
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• 2003

Methylation of DNA 5-cytosine in mammalian early embryo affects great deal in nuclear reprogramming and chromatin remodeling of developing embryo. Current efforts to clone and produce cloned animals including transgenic animals face various problems including low birth rate, irregular development, and so on. In this report, cDNA for the one of house keeping methyltransfcrase, Dnmt1 was cloned from bovine somatic tissues and was analyzed for its nucleotide sequences to investigate the structure and function of the gene in bovine early development. Nucleotide sequence of bovine Dnmt1 homologue showed 76.8% identity with that of human Dnmtl and 66.4% with mouse Dnmt1. Translated amino acid sequence showed 88.4% homology with human homologue and 75.8% homology with mouse counterpart. Three types of Dnmt1 are reported in mouse and human, and are likely present in bovine tissues. Understanding of role of Dnmt1 in bovine development may shed a light in the field of animal, especially bovine cloning.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.100-100
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• 2002

As an preliminary experiment for making transgenic animals producing human follicle stimulating hormone (hFSH), we tried to express recombinant hFSH gene in vitro. hFSH is a heterodimeric glycoprotein hormone produced in the anterior pituitary gland. The hormone is essential in the regulation of reproductive processes, such as follicular development and ovulation. Genes encoding the common gonadotrophin alpha subunit and FSH-specific beta subunit were inserted into retroviral vectors under the control of the rat beta actin promoter. Gene transfer to the Chinese hamster ovary (CHO) cells was done by infection of the retroviruses harvested from PT67 packaging cells transfected with recombinant retrovirus vector DNA. After selection with G4l8, PCR and RT-PCR analyses of the G4l8-resistant CHO cells showed successful transfer and expression of both ${\alpha}$ and ${\beta}$ fragments of the FSH gene.

• 한국수정란이식학회지
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• 제25권2호
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• pp.117-125
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• 2010

Several cloned animals have been produced using somatic cell nuclear transfer (SCNT) and have interested in producing the transgenic cloned animals to date. But still its efficiency was low due to a number of reasons, such as sub-optimal culture condition, aberrant gene expression and nuclear reprogramming. The purpose of this study was to analyze gene expression pattern in in vitro fertilized (IVF) or SCNT pre-implantation embryos. IVF- or SCNT-embryos were cultured in media supplemented with different proteins (FBS and BSA) or energy sources (glucose or fructose). Blastocysts from IVF or SCNT were analyzed using semi-quantitative RT-PCR in terms of developmentor metabolic-related genes. Culture medium supplemented different proteins or energy sources had affected on the expression of developmental or metabolic genes in the SCNT blastocysts.

• 농업과학연구
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• 제33권1호
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• pp.35-41
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• 2006

이종간의 핵이식은 확보가 쉬운 난자를 이용함으로서 용이한 수핵란의 확보와 윤리적인 문제등을 피할 수 있으므로 매우 유용한 방법이다. 본 연구에서는 이러한 이종간 핵이식의 조건을 규명하고자 유산양 태아섬유아세포를 이용하여 돼지의 난자에 이종간 핵이식을 시도하였다. 돼지와 산양의 난소에서 난포란을 채취하여 각각 NCSU-23, TCM-199에 호르몬을 첨가한 성숙배양액에 배양하여 $38^{\circ}C$, 5% $CO_2$의 배양기에서 48시간 동안 체외성숙 시켜 수핵난자를 준비하였다. 공여세포는 유산양의 태아섬유아세포는 DMEM배양액에서 배양한 후 0.25% Trypsin-EDTA 용액으로 처리하여 single-cell로 분리하여 사용하였다. 돼지와 산양의 성숙란에 공여세포를 핵치환하여 0.3 M mannitol fusion medium에 넣어 각각 DC 1.2 kV/cm $30{\mu}sec$과 DC 2.39 kV/cm $15{\mu}sec$의 조건으로 BTX를 이용 2회의 전기충격으로 융합 활성화하였다. 활성화된 돼지와 산양 핵이식란은 각각 PZM-3와 mSOF 배양액에 7일간 배양하면서 할구분열율과 배발달율을 관찰하여 동종간 핵이식란과 비교하였다. 비교결과 이종간 핵이식란의 경우 분열률이 58.9%, 배반포기로의 발달률이 5.4%로 돼지 동종간 핵이식란의 분열율이 67.4%, 배반포기로의 배발달율은 13.6% 보다 낮게 나타났고, 또한 산양의 동종간 핵이식란배아의 분열율 81%, 상실배와 배반포기로의 발달률이 54.7% 보다 낮게 나타났다. 이러한 결과로 이종간의 이식은 많은 잇점에도 불구하고 아직은 낮은 배발달률을 보이고 있어 이에 대한 핵이식 조건 및 체외배양 조건 등 많은 부분에서의 추가적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권4호
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• pp.371-378
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• 1997

본 연구는 인체 락토페린(hLF)을 우유 중으로 생산하는 형질전환 젖소의 개발에 관한 것이다. 이를 위한 모델 시스템으로서 락토페린 cDNAdhk 소의 베타-카제인 프로모터를 이용하여 형질전환 생쥐를 개발하였다. 발현 벡터의 락토페린에 대한 발현효율을 증가시키기 위하여 2개의 재조합 인트론을 삽입하였다. 20계통의 형질전환 생지를 개발하였는데 유즙에서의 락토페린 발현량은 1~200$\mu\textrm{g}$/ml이었다. hLF RNA의 발현 양상을 유선조직을 포함하여 뇌, 신장, 간 조직 등에서 조사하였을 때, 오직 유선에서만 발현되었을 뿐 아니라 엑손/인트론 경계 부위에서 정확하게 splicing되었다. hLF를 생산하는 형질전환 젖소를 개발하기 위하여 위에서 기술한 DNA를 소의 수정란에 미세주입한 후, 외과적 또는 비외과적 방법으로 대리모에 이식하였다. 한편, DNA가 주입된 수정란의 상태가 임신율에 미치는 영향을 조사하였다. 수정란을 최우수, 우수, 보통 등 3등급으로 나누었을 때, 각각의 임신율은 38.9, 15.4, 14.3%로 나타났다. 현재까지 유전자가 주입된 수정란을 대리모에 이식하여 태어난 35마리의 송아지 중, 30마리는 형절전환되지 않았으며 나머지는 현재 분석 중에 있다. 이상의 결과로 본 연구자들은 DNA가 미세주입된 젖소 수정란의 배양과 이식에 필요한 제반 기술을 확립하였으며, 아울러 임신율에 영향을 주는 여러 인자들에 대한 연구도 함께 조사하였다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권4호
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• pp.453-458
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• 1997

형질전환 동물의 후손에서 transgene은 멘델의 법칙에 따라 유전된다고 일반적으로 인식되어져 왔다. 따라서 본 연구에서는 transgene이 이러한 인식과 일치하는지를 여러 세대를 통하여 확인하고 후손에서 어떻게 유전되는지를 연구하기 위하여 형질전환 생쥐를 생산하여 본 연구의 모델로 삼았다. 수정된 생쥐의 embryo에 DNA를 microinjection하는 방법으로 MMTV-LTR (long terminal repeat), bovine ($\alpha$s1-casein cDNA, 그리고 SV 40 splicing과 polyadenylation site 등의 sequence를 포함한 3.0Kb의 DNA가 주입되었다. 여기에서 태어난 새끼는 dot blot과 Southern blot에 의하여 transgene의 존재여부가 확인되어 founder line이 만들어졌다. 그들의 자손은 PCR에 의해서 transgene이 유전되는지를 확인하였다. F0의 72마리 새끼중에서 4마리의 Founder가 transgene을 가지고 있었다(5.6%). F0에서 F1으로의 유전(transmission)은 각각 33.3, 7.7, 0, 62.5%이었다. Transgene은 F1에서 F2로 각각 63.6, 5.9, 68.8% 유전되었고, F2에서 F3로 각각 85.7, 0, 88.2% 유전되었다. 따라서 본 연구 모델에 의하면 transgene은 멘델의 법칙을 따르는 경우와 deletion이 되는 경우로 각각 관찰되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권4호
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• pp.375-380
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• 2007

국내 옥수수 순계주에서 Agrobacterium 공동배양으로 CP4 5-Enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EPSPS) 유전자가 도입된 제초제저항성식물체를 개발하였다. 5개의 순계주 (HW1, KL103, HW3, HW4, HW7)의 미숙배를 Ubiquitin promoter-CP4 EPSPS 유전자와 CaMV35S promoter-nptII 유전자가 발현되도록 제조된 pCAMBIA2300 벡터를 C58C1 Agrobacterium에 형질전환하여 공동 배양하였다. 항생제로 paromomycin이 첨가된 배지에서 선발된 옥수수 형질전환체를 PCR, RT-PCR 및 Northern 분석을 통하여 유전자의 도입과 발현을 확인하였다. 또한 형질전환 식물체의 glyphosate 처리에 따른 shikimate 축적반응을 확인하였다. Paromomycin 저항성 캘러스 형성빈도는 옥수수 각 순계주 HW1, KL103, HW3, HW4, HW7에서 각각 0.37%, 0.03%, 2.20%, 2.37%, 0.81%로 나타났으며, PCR분석을 통하여 최종적으로 2개의 옥수수 순계주 (HW3, HW4)의 paromomycin 저항성 캘러스로부터 분화된 식물체에서 확인하였다. 이러한 형질전환체중에서 RT-PCR 및 Nothern blot 분석을 통하여 CP4 EPSPS 유전자가 발현되는 2개의 계통 (M266, M104) 을 선발하였고, shikimate 축적반응을 통하여 glyphosate에 대한 저항성을 갖는 계통 (M266)을 최종적으로 선발하였다. 이러한 결과는 국내 옥수수 순계주에서 제초제저항성을 갖는 옥수수 형질 전환체를 개발할 수 있음을 시사한다.

• 한국자원식물학회:학술대회논문집
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• 한국자원식물학회 2003년도 제10차 국제학술회의 및 추계정기 학술발표회
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• pp.21-21
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• 2003

An efficient plant regeneration system was developed for Hordeum vulgare L. cv Baegdong - an important Korean cultivar. The protocol was based on a series of experiments involving the sizes of mature embryos and the culture media. The embryo size is found to be critical for the establishment of embryogenic callus. Embryos of 1.1-1.5 mm size showed a much higher ability to produce embryogenic callus capable of regenerating green plants. The auxins picloram and dicamba proved effective in inducing callus from mature embryos. 2.5 mg $I^{-1}$ dicamba and 4.0 mg $I^{-1}$ picloram in Murashige and Skoog's (MS) medium was optimum for the induction of primary callus. The induced primary callus was loose and friable which ultimately developed into creamy white and compact callus after transferring into the fresh medium. Multiple shoots were induced in the MS medium supplemented with 6.0 g $I^{-1}$ maltose, 20 mg $I^{-1}$ sorbitol, 0.5 mg $I^{-1}$ 2,4-D and 1.0 mg $I^{-1}$ kinetin and the rate was 6.5 shoots per embryo. Regenerated plants were hardy and developed roots rapidly in the medium containing 0.2 $I^{-1}$ IBA. This efficient plant regeneration system provides a foundation for generating transgenic plants of this important barley cultivar.

• 한국수정란이식학회지
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• 제28권3호
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• pp.265-271
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• 2013

Cryopreservation and in vitro fertilization (IVF) protocols are important in genetic studies and applications to transgenic animals. Various studies about boar sperm cryopreservation have been studied for a long time. Those were about the use of extenders, the choice of sugars, the cooling and warming rates. The factors that influence the boar sperm are the dramatic changes in temperatures, osmotic and toxic stresses, and reactive oxygen species (ROS) generation. Among these factors, ROS generation is the main damage to DNA which is a principal genetic material and the most important for the practical applications. So we wondered whether ROS generation could be reduced. In previous study, monothioglycerol (MTG) was essential for the culture of embryo stem cells. Therefore we added MTG in the freezing extender based on lactose-egg yolk (LEY) with trehalose. For the assessment of the frozen-thawed sperm, we focused onmotility, membrane integrity and DNA damage. First, we used a computer-aided sperm analysis system for overall conditions of sperm such as motility and viability. Then we performed the sperm chromatin structure assay for DNA integrity and hypo-osmotic swelling test for membrane integrity. And our result showed the existence of MTG in the freezing extender caused less damage to DNA and higher motility in frozen-thawed boar sperm. Also we checked a relative antioxidant activity of MTG in modified Modena B extender. We concluded that this reagent can activate sperm mitochondria at MTG $0.2{\mu}M$, contribute to sperm motility and DNA integrity but there was no significant difference on membrane integrity. Also antioxidant activity of MTG in modified Modena B extender was proved.