• 한국수정란이식학회지
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• 제30권3호
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• pp.207-211
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• 2015

미세주입법에 의한 형질전환 마우스 제작에는 대량의 전핵기란을 필요로 한다. 본 실험에서는 심플한 형질전환 마우스 제작방법을 확립하기 위해 초급속 동결한 전핵기란을 공시했다. 초급속 동결법으로 동결한 전핵기 체외수정란 139개를 융해 후 공시하고, ${\beta}-actin/luc^+$ 융합유전자를 미세주입하였다. 주입 조작 후, 형태학적으로 정상적인 수정란 101개(72.6%)를 5마리의 수란암컷 마우스에 이식하였다. 그 결과, 이식한 모든 마우스가 임신하고, 최종적으로 15마리(14.8%)의 산자가 태어났다. 한편, 450개의 체외수정란에 대해 동일한 배아조작 후에 338개(75.1%)가 생존하고 14마리의 수란암컷 마우스에 이식 하였다. 그 중에 78%의 수정암컷 마우스가 임신하고, 54마리(19.1%)의 산자가 태어났다. 태어난 산자에 대해서는 southern blot 법에 의해 염색체 내의 도입유전자의 도입을 확인한 결과, 동결수정란 처리구와 체외수정란구에서 각각 6.6%(1/15), 5.5% (3/54)의 마우스에서 도입유전자의 도입이 확인되었다. 더욱이 두 처리구 전부의 형질전환 마우스의 미부조직에서 도입유전자인 루시페라제 유전자의 발현이 관찰되었다. 이상의 결과에 의해 체외수정란 초급속 동결보존법을 사용한 Tg 마우스 제작방법의 확립을 확인하였고, 이러한 결과들로부터 실험기간의 단축과 작업의 간소화에 크게 이바지할 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제26권1호
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• pp.85-89
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• 2011

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a useful tool for reproducing genetically identical animals or producing transgenic animals. Many reports have demonstrated that the efficiency of animal cloning by SCNT requires reprogramming of the somatic nucleus to a totipotent like-state. The SCNT-related reprogramming might mimic the natural reprogramming process that occurs during normal mammalian development. However, recent evidence indicates that the reprogramming event by SCNT is incomplete. In this study, the traditional SCNT procedure (TNT) was modified by injecting donor nuclei into recipient cytoplasm prior to the enucleation process to expose the donor nucleus before removing the karyoplast containing the chromosomes of the oocytes which might possess additional reprogramming factors, and this modified technique was named as reversing the usual order of SCNT (RONT). Other procedures including activation and in vitro culture were the same as TNT. Contrary to expectations, the rate of blastocyst development was not different significantly between RONT and TNT (8.6% and 7.9%, respectively). However, duration of micromanipulation performed by the same technician and equipments was remarkably reduced because the ruptured oocytes after nuclear injection were excluded from the enucleation process. This study suggests that RONT, a simplified SCNT protocol, shortens the duration of SCNT procedure and this less time-costing protocol may enable the researchers to perform murine SCNT easier.

• 한국자원식물학회지
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• 제17권2호
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• pp.161-168
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• 2004

Ferritin light heavy chain (FLHC) gene는 일부 중금속과 결합, 저장 및 운반하여 무독화 시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. Fe 관련 유전자인 FLHC유전자를 식물 발현용 promoter인 35S promoter와 Tnos를 사용하여 식물 형질전환용 vector를 재조합하였다. 식물세포형질전환용 binary vector는 상기 cassette vector가 조립이 매우 양호하며 border sequence를 가지고 있는 pRD400 binary vector를 사용하여 최종적으로 가나마이신 내성 유전자 (NPT II gene)와 tadpole ferritin heavy chain gene 및 human ferritin light chain gene를 함유하고 있는 binary vector를 재조합하였다. Binary vector의 아그로박테리움에 도입은 triparental mating 방법에 의하여 수행하여 AB배지 및 가나마이신 함유 배지에서 disarmed Ti-vector를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP90/FLHC을 선발하였다. FLHC 유전자 도입된 식물형질전환용 binary vector를 이용하여 형질전환방법을 변형하여 많은 embryo를 유도하였으며 유도된 embryo들은 GA 10mg/L가 첨가된 배지에 지상부를 유도하였다. 형질전환체식물체의 정상적인 생장을 유도하기 위해 최적의 배양조건을 조사하였던 바, 비교적 1/3 MS배지에서 뿌리의 생장과 지상부의 생장이 균일하게 생장하는 경향을 보였으며, 뿌리와 줄기가 잘 발달된 약 7cm의 유식물체를 대량으로 증식하여, 모래와 흙이 1:1로 혼합된 토양에 옮겼다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제36권4호
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• pp.237-241
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• 2012

Embryonic genome activation (EGA) is the first major transition that occurs after fertilization, and entails a dramatic reprogramming of gene expression that is essential for continued development. Although it has been suggested that EGA in porcine embryos starts at the four-cell stage, recent evidence indicates that EGA may commence even earlier; however, the molecular details of EGA remain incompletely understood. The RNA polymerase II of eukaryotes transcribes mRNAs and most small nuclear RNAs. The largest subunit of RNA polymerase II can become phosphorylated in the C-terminal domain. The unphosphorylated form of the RNA polymerase II largest subunit C-terminal domain (IIa) plays a role in initiation of transcription, and the phosphorylated form (IIo) is required for transcriptional elongation and mRNA splicing. In the present study, we explored the nuclear translocation, nuclear localization, and phosphorylation dynamics of the RNA polymerase II C-terminal domain in immature pig oocytes, mature oocytes, two-, four-, and eight-cell embryos, and the morula and blastocyst. To this end, we used antibodies specific for the IIa and IIo forms of RNA polymerase II to stain the proteins. Unphosphorylated RNA polymerase II stained strongly in the nuclei of germinal vesicle oocytes, whereas the phosphorylated form of the enzyme was confined to the chromatin of prophase I oocytes. After fertilization, both unphosphorylated and phosphorylated RNA polymerase II began to accumulate in the nuclei of early stage one-cell embryos, and this pattern was maintained through to the blastocyst stage. The results suggest that both porcine oocytes and early embryos are transcriptionally competent, and that transcription of embryonic genes during the first three cell cycles parallels expression of phosphorylated RNA polymerase II.

• International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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• 제31권2호
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• pp.85-89
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• 2015

This peptide has antibacterial activity against several Gram-positive and Gram-negative bacteria. Bombyx mori cecropinB1(BmCecB1) is antimicrobial peptides from Bombyx mori and belongs to cecropin family. Antimicrobial peptides are important components of the innate immune systems in all living organism. To produce the BmCecB1 antimicrobial peptide, we constructed transgenic silkworm that expressed BmCecB1 gene under the control BmA3 promoter using piggyBac vector. The use of the 3xP3-driven EGFP cDNA as a marker allowed us to rapidly distinguish transgenic silkworm. Mixtures of the donor vector and helper vector were micro-injected into 600 eggs of bivoltin silkworms, Baegokjam. In total, 49 larvae (G0) were hatched and allowed to develop into moths. The resulting G1 generation consisted of 22 broods, and we selected 2 broods containing at least 1 EGFP-positive embryo. The rate of successful transgenesis for the G1 broods was 9%. We identified 9 EGFP-positive G1 moths and these were backcrossed with wild-type moths. With the aim of identifying a BmCecB1 as antimicrobial peptide, we investigated the Radical diffusion Assay (RDA) and then demonstrated that BmCecB1 possesses high antibacterial activities against Gram-negative bacteria.

• 한국가금학회지
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• 제31권4호
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• pp.293-298
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• 2004

본 연구는 기존의 형질전환 닭 생산방법 중의 하나인 1세 포기 수정란에 유전자를 직접 주입하는 유전자 미세주입방법을 개선할 목적으로 리포좀과 외래 표지 발현유전자인 GFP를 사용하여 외래유전자의 핵전이 효율성과 주입된 외래 유전자의 발현의 지속성을 닭의 배자에서 검증하고자 시도하였다 외래유전자는 배반엽 단계 혹은 1세포기 수정란의 세포질에 리포좀과 유전자의 혼합물 혹은 오직 유전자만을 미세주입을 하였다. 연구 결과들은 리포좀을 사용한 경우 naked DNA에 비하여 배반엽 단계와 1세포기 수정란 모두에서 효율적으로 외래 유전자를 핵내로 도입할 수 있음을 배양 3과 4일차 닭의 배자에서 GFP발현 양상을 통하여 확인하였다. 또한 주입된 외래 유전자에 의해 만들어진 GFP는 배자에서 일주일 정도 지속적으로 발현됨이 관찰되었다. 리포좀 방법은naked유전자 주입 방법에 비해 1세포기와 배반엽 단계 수정란 모두에서 효율적으로 외래 유전자를 핵내로 이동시키는 능력을 가지나, 주입된 유전자의 염색체 삽입에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다. 따라서 닭의 수정란에서 리포좀 방법은 외래유전자 도입에 유용한 수단으로 이용되어질 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권2호
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• pp.85-93
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• 2006

본 연구는 소 형질 전환 체세포 핵이식에서 용이한 탈핵을 위해 demecolcine을 이용할 시 탈핵율과 핵이식란의 발육능을 높이기 위한 최적의 조건을 알아보고자 실시되었다. 도축장 유래 미성숙 난자를 18시간 체외성숙 후 제1극체가 확인된 성숙 난자를 0.1, 0.2, 0.4 및 0.8 ug/ml의 demecolcine이 첨가된 배지에서 1시간 더 처리한 다음 세포막이 돌출되어 있는 난자를 체세포 핵이식에 공여하여 각 군간 배반포로의 발육능을 비교하였다. Demecolcine 처리 후 핵이 포함된 셰포막의 protrusion rates를 각 군간 비교한 결과 0.2, 0.4 및 0.8 ug/ml 군에서 0.1 ug/ml 군보다 유의적으로 높았으며 (82.8, 86.2, 90.4 vs. 70.1%), conventional blind 방법과 비교한 결과 demecolcine를 이용한 군에서 유의적으로 높은 탈핵율을 보였다(75.3 vs. 96.2%; p<0.05). 체세포 핵이식란의 발육능 비교에서는 0.1 및 0.2ug/ml 군에서 대조군과 함께 유의적으로 높은 분할율 및 배반포로의 발육능을 보였다(p<0.05). 결론적으로 소 형질전환 체세포 핵이식을 위한 탈핵시 높은 탈핵율과 배반포로의 발육율을 얻을 수 있는 demecolcine의 적정농도는 0.2ug/ml이라고 사료된다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제32권2호
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• pp.91-95
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• 2005

옥수수 미숙배배양과 Agrobacterium tumefaciens공동배양법에 의해 형질전환체를 생산하였다. Hi II계통의 미숙배를 Ubiquitin 1 promoter-GUS유전자와 선발마커로서 nptII 유전자로 제작된 pPTN290벡터를 C58C1에 도입한 후 형질전환 균주로 사용하였다. 7개의 paromomycin저항성 배 발생캘러스를 얻었으며, GUS양성반응을 나타내는 7개의 독립적인 식물체를 얻었다. Southern분석법에 의하여 $T_1$세대 식물체로부터 nptII유전자가 안정적으로 도입되어 있음을 확인하였다.

• Molecules and Cells
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• 제41권12호
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• pp.1072-1080
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• 2018

A plant-specific B3 domain and AP2 domain-containing transcription factor, RAV1 acts as a negative regulator of growth in many plant species and its transcription was down-regulated by BR and ABA. In this study, we found that RAV1-overexpressing transgenic plants showed abnormally developed ovules, resulting in reduced seed size, weight, and number in a silique. Interestingly, the endogenous expression of RAV1 fluctuated during seed development; it remained low during the early stage of seed development and sharply increased in the seed maturation stage. In plants, seed development is a complex process that requires coordinated growth of the embryo, endosperm, and maternal integuments. Among many genes that are associated with endosperm proliferation and embryo development, three genes consisting of SHB1, MINI3, and IKU2 form a small unit positively regulating this process, and their expression was regulated by BR and ABA. Using the floral stage-specific RNAs, we found that the expression of MINI3 and IKU2, the two downstream genes of the SHB1-MINI3-IKU2 cascade in the seed development pathway, were particularly reduced in the RAV1-overexpressing transgenic plants. We further determined that RAV1 directly binds to the promoter of MINI3 and IKU2, resulting in their repression. Direct treatment with brassinolide (BL) improved seed development of RAV1-overexpressing plants, but treatment with ABA severely worsened it. Overall, these results suggest that RAV1 is an additional negative player in the early stages of seed development, during which ABA and BR signaling are coordinated.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제30권3호
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• pp.233-239
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• 2003

We have developed a reliable and high-frequency genetic transformation and regeneration system via somatic embryogensis of Eleutherococcus sessiliflorus. Embryogenic callus obtained from seed were co- cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA101/pIG121Hm harboring genes for intron-$\beta$-glucoronidase(GUS), kanamycin and hygromycin resistance. Following co-cultivation, two types of samples(fine embrogenic calli and early globular embryo clusters) were cultivated on Murashige and Skoog(MS) medium containing 1 mg/L2.4-D for 3day in dark. Transient expression of GUS gene was found to be higher in the early globular embryo clusters than in the embryogenic calli. Also, co-cultivated period affected expression of GUS gene; the best result was obtained when globular embryo clusters were co-cultivated with Agrobacterium for 3 days. Subsequently, this callus transferred to selective MS medium containing 1mg/L2.4-D, 50mg/L kanamycin or/and 30mg/L hygromycin and 300mg/L cefortaxime. These embryogenic calls were subcultured to the same selection medium at every 2 weeks intervals. Approximately 24.5% of the early globular embryos co-cultivated with Agrobacterium for 3days produced kanamycin or/and hygromycin-resistant calli. Transgenic somatic embryos were converted into plantlets in half strength MS medium supplemented with 3mg/L GA$_3$ kanamycin and were confirmed by GUS histochemical assay and polymerase chain reaction analysis. Genomic Southem blot hybridization confirmed the incorporation of NPT II gene into the host genome.