• 한국버섯학회지
• /
• 제9권3호
• /
• pp.91-95
• /
• 2011

느타리버섯은 가장 중요한 식용버섯 중 하나이다. 느타리버섯은 Pseudomonas tolaasii에 의한 세균성 갈변병에 매우 감수성이므로, 저항성 품종을 만들기 위한 노력의 하나로 누에에서 분리된 항 세균성 단백질인 누에신을 느타리버섯에서 과발현시키고자 하였다. 누에신 cDNA는 여름 느타리버섯의 ${\beta}$-tubulin 프로모터에 결합되어 pTRura3-2 vector와 함께 우라실 영양요구성 돌연변이 균주에 형질전환되었다. 누에신 cDNA가 형질전환된 느타리버섯을 genomic PCR과 Southern blot을 통하여 분리할 수가 있었으며, 이들 중 3개의 형질전환체가 누에신 유전자를 발현시킴을 확인하였다. 그러나 이들 형질전환체들에서 누에신 단백질을 검출할 수 없었으며, 또한 항 세균 효과도 확인할 수 없었다. 이들 결과는 형질전환기술을 이용한 병 저항성 개발 가능성을 보여주고 있다.

• 한국자원식물학회지
• /
• 제17권1호
• /
• pp.28-33
• /
• 2004

본 연구는 개량 포플러 현사시 3호를 재료로 제초제 저항성 유전자 PAT으로 형질전환시 킨 다음 제초제 Basta처리에 의한 효율적인 형질전환체 선발을 목적으로 시험되었다. Basta 처리에 따른 캘러스유도, 부정아유도 및 액아유도 시험을 통해 조직치사 농도는 1.0mg/L로 결정할 수 있었으며, 이 농도처리에 의해 형질전환체의 조기선발에 사용하였다. 이 농도처리로 비형질전환체는 모두 고사되었지만, 형질전환체는 정상적으로 반응을 보이며, 생육이 가능하였다 .한편, 형질전환체에 제초제를 직접 살포한 결과, 정상적 생육이 가능했고, PAT activity측정 결과에서도 양성 반응을 나타내어 현사시 3호 세포내에 PAT유전자가 정상 발현됨이 확인되었다. 이로써 현사시에 PAT유전자 도입 및 발현을 위하여 제초제 Basta 처 리와 PAT assay가 매우 효과적인 것으로 나타났다.

• 한국균학회지
• /
• 제38권1호
• /
• pp.48-53
• /
• 2010

팽이버섯의 다양한 유전자의 기능을 연구하기 위한 방법으로 팽이 자실체의 주름조직을 사용하여 A. tumefaciens을 매개로 한 형질전환을 수행하였다. Hygromycin 항생제 저항성 유전자를 포함하고 있는 AGL-1 pBGgHg를 팽이버섯의 자실체 조직에 도입시킴으로서 형질전환체들을 얻을 수 있었다. 형질전환체 선발은 첫 번째로 hygromycin 선발 배지에서 선발한 뒤 gpd-FH, hph-R primer를 이용하여 PCR로 확인 할 수 있었다. hygromycin은 30 ug/ml에서 선발 효율이 가장 높았다. 형질전환체 중 일부는 갈색 자실체를 갖는 wild type과는 달리 백색 자실체를 나타내었다. 형질전환체의 southern blot결과 외래유전자가 팽이버섯 내부에 하나 또는 그 이상의 다양한 copy 수로 삽입되어 있음을 알 수 있었다. 또한 삽입된 유전자의 주변 염기서열에 대한 정보는 Inverse PCR을 통해 알 수 있었다.

• Journal of Microbiology
• /
• 제43권5호
• /
• pp.417-423
• /
• 2005

In this study, the nematode-trapping fungus, Monacrosporium sphaeroides, was transformed with a plasmid harboring the hygromycin B phosphotransferase gene, via restriction enzyme-mediated integration (REMI). Frequencies of up to 94 transformants ${\mu}g^{-1}$ per linearized plasmid DNA were obtained by optimizing the PEG concentration, as well as the category and quantity of the added restriction enzyme. $90\%$ of the transformants were determined to be stable for drug resistance when 20 randomly selected transformants were tested. Southern analyses revealed that the transforming DNA was integrated into the M. sphaeroides genome either with or without rearrangement. Five mitotic stable mutant strains were obtained using this approach, all of which had been altered with regard to sporulation capacity and pathogenicity toward nematodes. Southern blot analyses of the five mutants revealed that foreign plasmid DNA had integrated into the genome. Three of the mutants, Tms2316, Tms3583 and Tms1536, exhibited integration at a single location, whereas the remaining two, Tms32 and Tms1913, manifested integration at double or multiple locations. Our results suggest that the transformation of M. sphaeroides via REMI will facilitate insertional mutagenesis, the functional analysis of a variety of genes, and the tagging or cloning of genes of interest.

• 한국자원식물학회지
• /
• 제14권3호
• /
• pp.235-240
• /
• 2001

Polyphenol 화합물이 다량 함유된 식물종의 유연관계 분석이나 형질전환 유전자 확인 등을 위해 PCR을 이용할 경우 다량의 재료로부터 신속 간편하게 분리한 DNA를 이용할 수 있는 조건을 설정 하였다. 폴리페놀 함량이 높은 포도, 사과, 복분자와 같은 과수류에서 간편법에 의해 추출된 DNA를 이용한 PCR 반응액에 2%의 BLOTTO를 첨가함으로서 DNA의 재현적 증폭이 가능하였다. 간편 추출 DNA를 이용한 PCR에서 의 BLOTTO효과는 primer, 품종, 식물종에 관계없이 일반적으로 발현되었다. 상추의 형질전환 유전자 검색을 위한 PCR에서 도 BLOTTO 효과가 확인되었다. 따라서 PCR 반응액에 2% BLOTTO를 첨가하면 간편 법 에 의해 추출된 polyphenol 화합물 고함유 식물종의 DNA를 이용하여서도 PCR에 의한 유전배경 및 특정 유전자의 대량 신속 분석이 가능할 것이다.

• Journal of Plant Biotechnology
• /
• 제34권1호
• /
• pp.55-59
• /
• 2007

고추 형질전환은 Agrobacterium (LBA4404/pBI101 cyc600-syna-elicitin)을 이용한 cyc600 promoter에 구축된 elicitin 유전자의 형질전환시 shoot의 형성율은 수비초의 경우 3 mg/L zeatin과 0.05 mg/L NAA 함유 배지에서 11.1%, 4 mg/L zeatin과 0.05 mg/L NAA 함유 배지에서 12.8%였다. 전배양 3일, 공동배양 $3{\sim}4$일에서 재분화율이 높았다. 자엽으로부터 재분화된 형질전환체의 NPTII 유전자의 primer를 이용한 PCR 반응에서 형질전환된 재분화 식물체는 536 bp의 밴드를 확인하였다. Membrane에 blot하여 NPTII gene을 probe로 사용하여 Southern blot 분석에서 고추형질전환 식물체는 536 bp 부위에 강한 signal을 보였다. elicitin 유전자를 이용한 역병 저항성 형질전환체 수비초 $T_{0}$세대의 생육은 계통간에 다소 차이는 보였고, 계통 모두 생육은 저조한 반면 개화 및 수정 등의 임성은 정상적이었다. 자식을 통해 채종한 $T_{1}$ 식물체의 유전자 도입을 확인하기 위하여 PCR을 수행한 결과 $T_{0}$ 식물체 $S1{\sim}S5$ 계통에서 elicitin 밴드가 나타나 형질전환체임을 확인하였고, $T_{1}$식물체인 S1-1 등 7계통에서 elicitin 밴드가 나타났고, S1-2 등 4계통에서는 밴드가 나타나지 않아 형질전환체가 후대에서 분리가 일어남을 확인할 수 있었다. Syn ${\alpha}$ clone을 이용하여 Southern blot analysis를 한 결과 band가 나타난 300 bp 정도의 위치에서 blot이 나오는 것을 관찰할 수 있었다. 위의 결과에서 cyc600 promoter-syn ${\alpha}$의 construct가 수비초의 genomic DNA에 삽입되었는 것을 확인할 수 있었다. 고추형질전환체의 유묘에 역병균을 접종한 결과 유주포자 $10^{3}$개/mL에서 형질전환체의 저항성 계통선발이 가능하였다.

• 미생물학회지
• /
• 제52권3호
• /
• pp.249-253
• /
• 2016

먹물버섯의 하나인 Coprinellus congregatus는 생활사 동안 여러 종의 laccase 효소를 생성한다. 균사 끝 효소와 버섯시원체 효소 및 sclerotium (균핵) 효소들은 모두 이 균의 분화와 관련되었다. 이핵체 균사를 산성 액체배지(pH 4.0-4.5)에 접종하면 새로운 laccase가 합성되어 분비된다. 이 laccase 유전자의 프로모터의 어느 부분이 산 충격의 신호에 관련된 단백질이 결합하는가 분석하기 위하여 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자를 laccase 프로모터 2.0 kb 다음에 연결하고, 이를 형질전환 벡터인 pBARGEM7-1에 삽입함으로써 발현벡터를 구축하였다. 이 promoter-GFP 조합의 5'-region부터 차례로 제거한 짧은 길이의 이 발현벡터를 먹물버섯 교배형 a1균과 a2균에 형질전환 방법으로 도입시키고 phosphinothricin 저항성으로 형질전환체들을 선발하였다. 선발된 형질전환체 a1 (a1TF)과 a2 (a2TF)를 서로 교배하여 동형접합(homozygotic) 이핵체 형질전환체를 만들었다. 이들을 산성 액체배지에서 36시간 배양하고 균체를 모아 confocal microscope를 사용하여 형광을 분석하였다. Laccase 유전자의 전체 프로모터(2.0 kb)를 가진 발현벡터(F0-GFP)를 도입한 동형접합 형질전환체에서는 형광을 보였으나, 그 보다 짧은 길이(1.29 kb 이하)의 프로모터를 가진 형질전환체에서는 형광이 나타나지 않았다. 이 결과에 근거하여 먹물버섯의 산 충격에 대한 신호를 받는 부위가 laccase 유전자 프로모터의 -2.0 kb ~ -1.29 kb 사이에 있을 것으로 추정한다.

• 한국미생물학회:학술대회논문집
• /
• 한국미생물학회 2005년도 International Meeting of the Microbiological Society of Korea
• /
• pp.217.2-217
• /
• 2005

• 한국식물생명공학회:학술대회논문집
• /
• 한국식물생명공학회 2003년도 추계학술대회 발표논문 초록집
• /
• pp.122-122
• /
• 2003

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제10권3호
• /
• pp.287-292
• /
• 2000

Recombinant Aspergillus niger was constructed to express and secrete a biologically active murine granulaocyte macrophage-colony stimulating factor (mGM-CSF). A 500 bp fragment encoding the signal peptide and terminator of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpd). The hygromycin phosphotrasferase gene (hph) was used as a selection marker for the fungal transformants. An expression vector was introduced into A. niger ATCC 9642, and a Northern blot analysis indicated the presence of a considerable amount of transcripts from the introduced mGM-CSF. The biological activity of recombinant mGM-CSF (rmGM-CSF) isolated from the culture filtrate was confirmend by measuring the proliferationof the GM-CSF dependent FDC-P1 cell line. It appeared that rmGM-CSF was amenable to the proteolytic activity produced by A. niger, since biological actibity was only observed when the transformants were grown in a protease-repressing medium, and the activity of rmGM-CSF dramatically decreased with an increase of age of the culture. The yield of rmGM-CSF, as determined by ELISA. was 640 ng/l of culture filtrate. Accordingly, its specific activity is estimated to be approximately two-and-a-half times higher than that of a commercial preparation from E. coli.