• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제16권13호
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• pp.5343-5348
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• 2015

Promoter hypermethylation of the runt-related transcription factor 3 (RUNX3) gene is associated with increased risk of hepatocellular carcinoma (HCC). Oxidative stress plays a vital role in both carcinogenesis and progression of HCC. However, whether oxidative stress and RUNX3 hypermethylation in HCC have a cause-and-effect relationship is not known. In this study, plasma protein carbonyl and total antioxidant capacity (TAC) in patients with hepatitis B virus (HBV)-associated HCC (n=60) and age-matched healthy subjects (n=80) was determined. RUNX3 methylation in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of subjects was measured by methylation-specific PCR. Effect of reactive oxygen species (ROS) on induction of RUNX3 hypermethylation in HCC cells was investigated. Plasma protein carbonyl content was significantly higher, whereas plasma TAC was significantly lower, in HCC patients than healthy controls. Based on logistic regression, increased plasma protein carbonyl and decreased plasma TAC were independently associated with increased risk for HCC. PBMC RUNX3 methylation in the patient group was significantly greater than in the healthy group. RUNX3 methylation in hydrogen peroxide ($H_2O_2$)-treated HepG2 cells was significantly higher than in untreated control cells. In conclusion, increase in oxidative stress in Thai patients with HBV-associated HCC was demonstrated. This oxidative increment was independently associated with an increased risk for HCC development. RUNX3 in PBMC was found to be hypermethylated in the HCC patients. In vitro, RUNX3 hypermethylation was experimentally induced by $H_2O_2$. Our findings suggest that oxidative stress is a cause of RUNX3 promoter hypermethylation in HCC cells.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제24권1호
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• pp.70-79
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• 2014

In an attempt to develop a variety of expression vector systems for Corynebacterium glutamicum, six types of promoters, including $P_{tac}$, $P_{sod}$, $P_{sod}$ with a conserved Shine-Dalgarno (SD) sequence from C. glutamicum, $P_{ilvC}$, $P_{ilvC}$ with a conserved SD-1 ($P_{ilvC-M1}$), and $P_{ilvC}$ with a conserved SD-2 ($P_{ilvC-M2}$), were cloned into a modified shuttle vector, pCXM48. According to analysis of promoter strength by quantitative reverse transcription PCR, $P_{sod}$ and $P_{sod-M}$ were superior to tac and ilvC promoters in terms of transcription activity in C. glutamicum. All of the promoters have promoter activities in Escherichia coli, and $P_{sod-M}$ displayed the highest level of transcriptional activity. The protein expression in constructed vectors was evaluated by measuring the fluorescence of green fluorescent protein (GFP) and SDS-PAGE. C. glutamicum harboring plasmids showed GFP fluorescence with an order of activity of $P_{ilvC}$ > $P_{ilvC-M1}$ > $P_{sod}$ > $P_{ilvC-M2}$ > $P_{sod-M}$, whereas all plasmids except pCSP30 with $P_{sod}$ displayed fluorescence activities in E. coli. Of them, the strongest level of GFP was observed in E. coli with $P_{sod-M}$, and this seems to be due to the introduction of the conserved SD sequence in the translational initiation region. These results demonstrate that the expression vectors work well in both C. glutamicum and E. coli for the expression of target proteins. In addition, the vector systems harboring various promoters with different strengths, conserved SD sequences, and multiple cloning sites will provide a comfortable method for cloning and gene expression, and consequently contribute to the metabolic engineering of C. glutamicum.

• 미생물학회지
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• 제29권1호
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• pp.1-7
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• 1991

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) causes a deadly infectious disease, Acquired Immunodeficiency Syndrome (ADIS). As a first step to develop a reliable and fast diagnostic procedure for HIV-1 infection, we cloned various immunodominant epitopes of HIV-1 in bacterial expression vectors containing tac or trp promoter. While the protein level of direct expression of gp160 was low, trp E fused gp120, gp41 and p17-p24 were produced at high levels (15-30% of total bacterial proteins) in E. coli. Since gp120 and gp41 contain relatively conserved regions which can react with antibodies in the plasma from most of HIV-1 infected individuals, these expression clones were used for large preparations of HIV-1 antigens.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권4호
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• pp.283-288
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• 1989

최초로 구축된 $\beta$-xylosidase 유전자 함유 5.0kb HindIII 절편을 포함하는 pAX278의 Insert 크기를 줄이기 위하여 subcloning을 행한 결과, 1.4kb EcoRI-XbaI 절편이 subcloning되었으며 이를 pAK 208로 명하였다. Plasmid pAX208에 의해 형질전환된 대장균은 $\beta$-xylosidase 활성이 pAX278의 경우보다 약 1.3배 증가하였고 또한, $\beta$-xylosidase의 활성을 증가시키기 위하여 강력한 tac-promoter를 가진 pKK223-3 plasmid vector를 이용하여 대장균에 cloning 및 발현시켰을 때, pAX278을 가진 대장균 형질전환체와 유전자 source균인 호알칼리성 Bacillus속 K-17에 비하여 각각 약 3.3배 및 1.8배의 효소활성 증가를 나타내었다. 전체 5.0kb HindIII 절편을 cloning하여 Bacillus속 K-17에 발현시킨 균주는 각각 3.7배 및 2.0배의 $\beta$-xylosidase 활성증가를 보였다. 각 형질전환체로부터 정제된 $\beta$-xylosidase의 효소학적 특성은 Bacillus속 K-17과 거의 일치하였다.

• 미생물학회지
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• 제45권3호
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• pp.233-238
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• 2009

Corynebacterium ammoniagenes의 purF 유전자의 발현을 purF의 프로모터 추정 부위에 cat 유전자를 융합시킨 transcriptional fusion 플라스미드를 제작하여 분석하였다. 유전자 purF는 adenine과 guanine에 의해 20~30%의 전사 저해효과를 나타내지만, hypoxanthine에는 저해를 받지 않는 것으로 나타났다. 또한 purF의 발현은 대수기중반에 최대에 달한 후 정체기 후반부까지 일정한 것으로 나타났다. 동시에, C. glutamicum에서 사용되는 강력한 프로모터인 $P_{180}$이 Escherichia coli의 $P_{tac}$보다 C. ammoniagenes에서 모든 성장 단계에서 40~50%의 향상된 프로모터 활성을 나타내었고 대수기 후반부에 최고 활성에 달해, C. ammoniagenes의 연구에도 활용 가능함을 확인하였다. DNA-affinity purification에 의해 C. ammoniagenes의 purF 프로모터에 결합하는 단백질로서 C. glutamicum의 Crp-family transcriptional regulator (NCgl0120)와 상동성이 높은 단백질을 검출하였다. 이 단백질은 크기가 40.1 kDa으로서 PAGE에서 관찰된 단백질 크기와 일치하였다. 이에 상응하는 C. ammoniagenes의 단백질은 400개의 아미노산으로 구성되어 있고, 42 kDa의 단백질을 만들며, pI는 4.9일 것으로 추정되었다. 이는 기존에 알려져 있는 E. coli 및 Bacillus subtilis의 PurR과 각각 14.1%, 15.8%의 아미노산 상동성을 보여, PurR과는 다른 종류의 단백질일 것으로 여겨진다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제15권6호
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• pp.396-401
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• 1987

$\beta$-Galactosidase 유전자 조작된 두 대장균 숙주-벡터 시스템의 단백질 생산가 배양특성을 비교하였다. Tac 프로모터를 갖는 Escherichia coli JM109/ pTBG10 균주가 pL 프로모터를 갖는 E. coli MH 3000(pRKcI857)/ pASl(lacz) 균주보다도 단백질 생산성에 있어서 훨씬 우수하였으며 초기 및 중간 대수 증식기에서의 발현 유도가 단백질 생산에 있어서 유리함을 관찰하였다. 또한 유전자 발현시기에 있어서는 산소요구량이 매우 높았으나 pH를 일정하게 조절함에 의해 산소요구량을 어느 정도 낮출 수 있었고 생산성도 향상됨을 관찰할 수 있었다. 고생산성 균주(E. coli JM109/pTBG10)의 경우 플라스미드 함유 균체의 플라스미드 상실 균체에 대한 비증식속도의 비 $\mu$ + /$\mu$- 가 저생산성 균주보다도 낮았으며 이것은 유전자발현에 따른 단백질 합성부담이 매우 큰 때문으로 판단되었다. 또 플라스미드 안정성을 30세대까지 추적하였는바 유전자 발현 조건하에서 두 균주 모두 25세대 후 10% 정도의 안정성을 보였으나 E. coli JM109/pTBG10 균주의 안정성이 상대적으로 우수하다고 판단되었다.

• Journal of Microbiology
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• 제33권3호
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• pp.201-207
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• 1995

We have previously reported that SPP2 gene product of yeast Saccharomyces cerevisiae is involved in the pre-mRNA splicing. To investigate the rol ein the splicing pathway of the Spp2p protein, the SPP2 gene was overexpressed in Escherichia coli and polyclonal antibodies to Spp2p were generated from rabbits. First, a DNA fragment containing the SPP2 GENE without its promoter was subcloned into an E. coli expression vector, pKK233-3. The resulting recombinant plasmid pBQ14 contained an IPTG inducible tac promoter and the SPP2 structural gene. Overexpression of the SPP2 gene was achieved by additionof 0.1 to 1.0 mM IPTG to a logarithmic culture of E. coli JM103(pBQ14) for 90 min at 37.deg.C. Sequence of N-terminal 15 amino acids of the overproduced protein was well matched to the deduced one from the SPP2 reading frame. Then, polyclonal antibodies were generated from rabbits immunized with gel-purified SppSp protein. These antibodies reacted specifically with the Spp2p protein extracted from yeast cells expressing the SPP2 gene to a great extent. The antibodies could also block the activity of yeast splicing extracts.

• 대한의용생체공학회:의공학회지
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• 제20권1호
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• pp.99-106
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• 1999

인공관절용 재료의 내마모성 향상을 목적으로 초고분자량 폴리에틸렌(UHMWPE)을 가교시켜 기계적 성질과 내마모성을 조사하였다. 가교제로 dicumyl peroxide(DCP)를 사용하고 가교보조제로 triallyl cyanurate(TAC)를 사용하여 용융상태에서 UHMWPE를 가교시켰다. DCP와 TAC의 함량이 증가할수록 가교된 초고분자량 폴리에틸렌(XUMPE)의 젤 함량은 증가하고 녹는점, 결정화온도, 결정화도, 인장성질은 감소하였다. Pin-on-disk 마모시험과 작은 하중을 가한 ball-on-disk 마모시험에서는 기계적 성질의 감소에도 불구하고 XUMPE의 마모부피가 UHMWPE보다 감소하였다. 이 두 시험에서의 마모는 주로 변형에 의한 것으로 판단되었으며, 마모부피는 Hertz 접촉 이론으로 계산한 최대접촉응력과 XUMPE의 항복강도의 비에 비례함을 보였다. 큰 하중을 가한 ball-on-disk 마모시험에서는 기계적 성질이 낮을수록 더 큰 마모부피를 보였으며, 마모자국의 표면거칠기와 마찰계수도 증가하였다. 이는 인장강도를 넘는 응력이 가해졌을 때 항복강도와 인장강도가 더 낮은 XUMPEDml 변형과 파괴가 촉진되기 때문으로 생각되었다.

• Journal of Microbiology
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• 제33권2호
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• pp.165-170
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• 1995

The 356 amino acid long lambda integrase protein of bacteriophage .lambda. constains two autonomous DNA binding domains with distinct sequence specificities. The amino terminal domain of integrase is implicated to bind to the arm-type sequences and the carboxyl domain interacts with the coretype sequencess. As a first step to understand the molecular mechanism of the integrase-DNA interaction at the arm-type site, the int(am)94 gene carrying an amber mutation at the 94th codon of the int was cloned under the control of the P$\_$tac/ promoter and the lacI$\_$q/ gene. The Int(am)94 mutant protein of amino terminal 93 amino acid residues can be produced at high level from a suppressor free strain harboring the plasmid pInt(am)94. The arm-type binding activity of Int(am)94 were measured in vivo and in vitro. A comparison of the arm-type binding properties of the wild-type integrase and the truncated Int(am)94 mutant indicated that the truncated fragment containing 93 amino acid residues carry all the determinants for DNA binding at the arm-type sites.

• 한국응용약물학회:학술대회논문집
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• 한국응용약물학회 1994년도 춘계학술대회 and 제3회 신약개발 연구발표회
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• pp.266-266
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• 1994

$B^{30}$ 위치에 homoserine이 치환된 사람 insulin 유사체 ($B^{30}$ -homoserine) insulin을 생산하기 위해, insulin의 B 사슬 유전자에 A 사슬 유전자를 직접 연결한 insulin 유전자를 설계하였다. 이 유전자는 10개의 oligonucleotide로 나누어 합성하여 T4 DNA ligase로 결합시킨 후, pUC19 plasmi의 polylinker 영역에 삽입하였다. 이 유전자의 발현을 높이기 위해 이 유전자는 다시 tac promoter의 지배를 받는 lacZ 유전자의 Cia I 또는 Hpa I 제한부위에 도입하여 융합시켰다. 이렇게 구축된 운반체 pTBA나 pKBA를 Escherichia coli JM103 균주에 형질도입시킨 후, 이를 4시간 배양한 후 0.05mM이상의 isopropyl-$\beta$-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 배지에 공급해 주고 2시간 더 배양하였을 때 유전자 발현이 잘 유도되어짐을 알 수 있었다. 이 때 생산된 insulin 전구체들은 세포내 불온성인 inclusion body로 축적되어지는 것을 관찰하였으며, 그 생산량은 세포내 전체 단백질량의 30%에 달하였다.