• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권2호
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• pp.205-209
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• 2003

Recently, we introduced a new method for rapid screening of bacterial species- or subspecies-specific DNA probes, named “inverted dot blot hybridization screening method”. We then applied this method to develop species- or strain- specific DNA probes for Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens. In those studies, among 96 candidate DNA probes which were screened by the new method, 5 probes were confirmed as being putatively strain-specific : 3 probes for P. nigrescens 9336 (ATCC 33563), one for each p. intermedia ATCC 25611 and one for P. nigrescens G8-9K-3 (ATCC 49046). In the present study, we evaluated by Southern blot analysis a DNA probe Pi29-L, one of the 96 candidate probes described above, whether it is specific for the strain ATCC 25611 off. intermedia. Our data show that the probe Pi29-L is potentially P. intermedia ATCC 25611-specific, which can be useful for the detection and identification of the strain, particularly in maintenance of the strain.

• 한국연초학회지
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• 제19권2호
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• pp.117-123
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• 1997

Viral coat protein (CP) encoding cDNA with artificial start and stop codons was synthesized by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) from the Korean isolate of potato virus Y-vein nectrosis strain (pVY-VN). To make PVY CP cDNA to untranslatable form, three stop codons were inserted near the start codon by "megaprimer-PCR" method. The untranslatable CP cDNA was subcloned to plant expression vector and transferred to N. tabacum cv. NC82 by Agrobacterium-mediated transformation. Highly resistant plants to PVY infection were screened, based on symptom development after mechanical virus inoculation. By genomic PCR and Southern blot analysis, one or more copies of the untranslatable CP gene were found in all transformants. From northern blot analysis, highly resistant transgenic lines had very low level of CP transcript but susceptible lines had high level, suggesting resistance to PVY infection should be related to RNA-mediated mechanism.mechanism.

• 한국환경성돌연변이발암원학회지
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• 제19권1호
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• pp.28-33
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• 1999

The SNF2 family includes proteins from a variety of species with roles I cellular processes such as transcriptional regulation, recombination and various types of DNA repair. Several proteins with unknown function are also included in this family. Here, we report the cloning and characterization of hrp 2+ gene (helicase related gene from S. pombe) which was isolated by PCR amplication using the conserved domain of SNF2 motifs within the ERCC6 gene which encodes a protein involved in DNA excision repair. The hrp2+ gene was isolated by screening with yeast S. pombe genomic library. The isolated cloned contained 6.5 kb insert DNA. Southern blot analysis confirmed that S. pombe chromosome contains the same DNA as hrp2+ gene and this gene exists as a single copy in S. pombe genome. The 4.7 kb transcript of mRNA was identified by Northern blot. To examined the transcriptional regulation of hrp2+ gene, DNA damaging agents were treated. These results indicated that the hrp2+ gene may not be directly involved in DNA replication, but may be involved in damage response pathway.

• Applied Biological Chemistry
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• 제40권6호
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• pp.495-500
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• 1997

Cyclodextrin을 합성하는 효소 CGTase를 호염기성 Bacillus sp. E1으로부터 분리하기 위하여 PCR을 실시하였다. PCR을 위하여 합성한 primer의 염기서열은 현재까지 보고된 CGTase 유전자의 염기서열을 비교 분석하여 가장 높게 보존된 영역을 찾아내어 선택하였다. PCR 증폭 결과 1.2 kbp 크기의 DNA 절편을 얻을 수 있었고 이를 molecular probe로 이용하여 Southern blot 분석을 실시하였다. Southern blot 분석결과 CGTase 유전자는 염색체 DNA를 제한효소 XbaI으로 절단한 5.3 kbp 절편내에 존재한다는 사실을 알아내었다. CGTase 유전자를 분리하기 위하여 유전자 은행을 제조한 후 선별작업을 실시하여 genomic clone인 pCGTE1을 얻을 수 있었다. pCGTEl의 염기서열을 결정한 결과 분리한 CGTase 유전자는 2109 bp의 open reading frame을 가지며 이는 703개의 아미노산으로 구성된 단백질을 coding하는 것으로 나타났다. 아미노산 서열의 유사성을 비교한 결과 Bacillus sp. KC201의 CGTase 와 가장 높은 94.3% 동질성을 나타내었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제37권5호
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• pp.361-369
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• 1994

Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit(rbcS)의 광유도 발현과 엽록체로의 단백질 이동 메카니즘을 연구하기 위해 벼의 게놈으로부터 rbcS 유전자를 분리하여(GrbcS) 그의 염기서열을 결정하였다. GrbcS의 유전자 염기서열 결정 결과, 단백질 암호부위는 한 개의 intron과 두 개의 exon으로 이루어져 있고 이들은 47개의 transit peptide를 포함하는 175개의 아미노산을 암호화하는 것으로 밝혀졌다. GrbcS의 이러한 구조적인 성질은 다른 단자엽 식물의 그것과 비교적 일치하고 genomic Southern blot analysis 결과 rbcS 유전자는 벼의 게놈상에 상대적으로 적은 규모의 multigene family로 존재한다는 것이 밝혀졌다. GrbcS의 유전자 염기서열과 그로부터 유추된 아미노산의 염기서열은 벼로부터 분리된 다른 rbcS와 매우 유사함을 보였고 다른 식물체로부터 분리된 그것과도 높은 유사성을 보였다. GrbcS의 5’ 앞쪽 부분에는 G-box, 3AF1-binding site, GATA site와 같은 광유도 발현 유전자에 공통적으로 존재하는 염기서열을 지니고 있었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권2호
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• pp.109-113
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• 1998

본 연구에서는 상처, 병원균의 침입 등에 의하여 발현양이 크게 증폭되는 토마토 PAL유전자의 promoter에 giant silk moth(Hyalophora cecropia)로부터 분리한 lytic gene의 genetic code를 일부 변경한 Shiva 유전자를 부착하여 담배, 감자 등의 작물에 형질전환을 시도하였다. 형질전환된 담배로부터 얻은 종자에 대한 kanamycin저항성 유전자의 유전분석, PCR 증폭 혹은 genomic Southern blot hybridization에 의하여 tPAL5 promoter-Shiva fusion gene의 염색체내로의 integration을 확인하였다. Kanamycin 저항성 유전자의 유전분석에서 선발된 7개체를 PCR 분석 실시한 결과 모든 개체가 positive임이 확인되었으나, genomic Southern blot Hybridization으로는 4개체가 negative로 나타났다. 특히 한 개체의 경우는 chromosome rearrangement 현상이 일어난 것으로 추정되었다. 감자의 경우는 남작(Irish Cobbler) 품종이 Zeatin 2.0 mg/L NAA 0.01 mg/L, GA$_3$ 0.1mg/L을 포함한 배지에서 callus형성율 및 shooting율이 가장 높아서 재분화된 형질전환체를 얻을 수 있었다. 한편 GUS 유전자는 Shiva 유전자의 3' 말단에 존재하는 NOS terminator 때문에 translation까지의 발현이 어려울 것으로 예상되었으나 형질 전환하지 않은 담배에서보다 10배 이상의 GUS활성을 나타내었다. 또한 감자 조직에 X-gluc을 사용하여 GUS($\beta$-glucuronidase)의 기질로 작용하게 하여 효소활성 자리를 염색한 결과 줄기, 잎, 뿌리 등의 도관 조직에 다량 발혈됨을 확인할 수 있었다.

• 한국육종학회지
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• 제42권5호
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• pp.534-539
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• 2010

사과 국내 육성 품종인 '홍로'의 형질전환 체계를 확립하고 칼슘이 강화된 '홍로' 형질전환체를 육성하기 위하여 CAX1 유전자 전환을 실시하였다. 접종에 사용되는 절편체는 기내에서 증식 배양 중인 신초의 유엽을 사용하는 경우가 생육기 수체의 유엽을 사용하는 것보다 높은 재분화율을 보여 효과적이었다. 항생제가 첨가된 재분화 선발 배지에서 재분화된 신초들을 대상으로 PCR을 실시한 결과 5개체에서 유전자 도입을 확인할 수 있었고, 이들을 Southern blot 분석한 결과 2개체에서 안정적으로 유전자가 도입되었음을 확인할 수 있었다. 또한 유전자의 정량적 발현 분석을 위해 real-time PCR을 실시한 결과 대조구에 비해 형질전환체 모두에서 CAX1 유전자의 상대적 발현량이 높게 나타났다. 형질 전환체의 칼슘 분석 결과 기내 증식 잎과 결실된 과실의 과육과 잎에서 칼슘 함량이 대조구에 비해 높게 나타났다.

• Environmental Analysis Health and Toxicology
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• 제20권1호
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• pp.67-73
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• 2005

오염물질의 노출에 의해 발현이 변화되는 유전자의 발굴은 외부환경 자극에 대한 적응이나 반응의 메커니즘을 알아내는뎨 중요한 정보를 제공하며, 오염물질에 반응하는 유전자는 환경오염을 감지하는 분자 마커로 개발될 수 있다. DD-PCR 기법은 차등 발현 유전자들을 발굴해내기 위한 유용한 방법으로 사용되어 왔고, 본 연구는 이 방법을 이용하여 벤조피렌에 반응하는 조피볼락 유전자들의 발굴을 목적으로 진행되었다. 간조직에서 추출한 RNA로부터 벤조피렌의 노출에 의해 발현 양이 달라진 12개의 클론을 발굴하였고, 그 염기서 열을 분석하였다. 또한 벤조피렌의 노출시간을 각각 6, 12, 24시간으로 달리한 조피볼락에서 12개의 클론 중 4개의 클론에 대해 northern blot 분석이 실시되었으며, 이들 모두 노출시간에 따 라 발현양이 증가 또는 감소하는 것이 확인되었다. 본 연구결과는 오염물질의 영향에 의한 유전자들의 발현에 관한 전반적인 지식을 제공하였고, 나아가 환경오염이나 외부 스트레스를 감지해 낼 수 있는 바이오마커의 개발을 위한 첫 단계로서의 정보를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.

• BMB Reports
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• 제31권3호
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• pp.303-306
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• 1998

Serine proteinase cDNA fragment from protozoan parasite Acanthamoeba culbertsoni was amplified by the reverse transcription-polymerase chain reaction (RTPCR) using degenerate oligonucleotide primers derived from conserved serine proteinase sequences. The amplified DNA fragment was subcloned and sequenced. The sequence analysis and alignment showed significant sequence similarity to other eukaryotic serine proteinases and conservation of the His, Asp, and Ser residues that form the catalytic triad. The cDNA fragment was cloned into the pGEMEX-1 expression vector and expressed in Escherichia coli. A resulting fusion protein of 56 kDa had proteolytic activity. The fusion protein reacted with sera of mice immunized with purified serine proteinase of A. culbertsoni in Western blot. Immune recognition of the fusion protein by mouse antisera suggested that the fusion protein may be valuable as a diagnostic reagent.

• 미생물학회지
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• 제31권2호
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• pp.136-140
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• 1993

A awamori 의 glucoamylase 유전자와 A. nidolans 의 trpC maker 유전자를 가진 A. nidulans 의 expression vector 를 만들었다. 이재조합 plasmid 를 트립토판 영양요구주의인 A. nidulans B17 에 형질전환시켰다. Southern blotting 으로 vector DNA 가 A. nidulans 의 chromosomal DNA 에 integration 된 것을 확인하였다. Northern blotting 의 결과, glucoamylase 유전자는 induction 조건에서 mRNA 를 합성하였다. glucoamylase 의 역가가 형질전환체에서 증가하였으며, nondenaturing polyacrylamide gel 에서 glucoamylase 의 활성이 나타났다.