• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제54권1호
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• pp.21-29
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• 2016

The sodium hydrogen exchanger 1 (NHE1), which functions in maintaining the ratio of $Na^+$ and $H^+$ ions, is widely distributed in cell plasma membranes. It plays a prominent role in pH balancing, cell proliferation, differentiation, adhesion, and migration. However, its exact subcellular location and biological functions in Toxoplasma gondii are largely unclear. In this study, we cloned the C-terminal sequence of T. gondii NHE1 (TgNHE1) incorporating the C-terminal peptide of NHE1 (C-NHE1) into the pGEX4T-1 expression plasmid. The peptide sequence was predicted to have good antigenicity based on the information obtained from an immune epitope database. After induction of heterologous gene expression with isopropyl-b-D-thiogalactoside, the recombinant C-NHE1 protein successfully expressed in a soluble form was purified by glutathione sepharose beads as an immunogen for production of a rabbit polyclonal antiserum. The specificity of this antiserum was confirmed by western blotting and immunofluorescence. The antiserum could reduce T. gondii invasion into host cells, indicated by the decreased TgNHE1 expression in T. gondii parasites that were pre-incubated with antiserum in the process of cell entry. Furthermore, the antiserum reduced the virulence of T. gondii parasites to host cells in vitro, possibly by blocking the release of $Ca^{2+}$. In this regard, this antiserum has potential to be a valuable tool for further studies of TgNHE1.

• 생명과학회지
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• 제22권2호
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• pp.142-147
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• 2012

효모 Saccharomyces diastaticus가 포자형성기에 세포질에서 생산된다고 알려진 포자형성 특이 glucoamylase (SGA)가 세포 외로 분비되는 단백질임을 증명하고자 S. dastaticus의 SGA promoter와 예상되는 분비신호서열 다음에 reporter gene으로 사용한 고초균의 CMCase 구조유전자를 융합한 재조합 플라스미드 pYSC25를 제작하고 수주세포인 S. diastaticus YIY345에 형질전환 하였다. 형질전환체를 1% CMC를 포함하는 최소한천배지에서 배양한 후 Congo red 염료로 염색하여 생성된 투명환으로부터 SGA의 분비서열에 의해 세균의 CMCase가 효모세포외로 분비되는 것을 확인하였다. 효모세포부위 별 CMCase의 활성분포를 측정하여 SGA 분비서열의 분비효율을 추정하기 위해 효모세포 배양액을 배양상등액, periplasmic 및 세포질 분획으로 나눈 다음 효소활성을 측정한 결과 CMCase 활성의 76%가 배양상등액과 periplasmic 부위에 존재하였으며 N-연결형 당쇄가 일어났으므로 SGA 분비서열은 효과적으로 작용함을 알 수 있었다. 대조균인 고초균에서 생산된 CMCase에서는 당쇄가 일어나지 않은 것을 확인하였다. 이상의 결과로부터 SGA는 아미노 말단에 존재하는, 24개의 아미노산으로 구성된 분비서열을 보유한 분비성 단백질임을 확인하였다.

• 한국환경농학회지
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• 제32권4호
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• pp.315-322
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• 2013

BACKGROUND: This study was performed for the identification and quantification of glucosinolate (GSL) contents in seven varieties of rapeseed (Brassica napus L.) sprouts cultivated under dark and light conditions. METHODS AND RESULTS: Crude glucosinolates (GSLs) were desulfated by treating with aryl sulfatase and purified using diethylaminoethyl sepharose (DEAE) anion exchange column. Individual GSLs were quantified using high-performance liquid chromatography (HPLC) with electrospray ionization-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). Eleven GSLs including six aliphatic (progoitrin, sinigrin, glucoalyssin, gluconapoleiferin, gluconapin, and glucobrassicanapin), four indolyl (4-hydroxyglucobrassicin, glucobrassicin, 4-methoxyglucobrassicin, and neoglucobrassicin) and one aromatic (gluconasturtiin) were identified based on the fragmentation patterns of MS spectrum. Aliphatic GSLs were noted as the predominant group with average 85.2% of the total contents. The most abundant GSLs were progoitrin which was ranged at $8.14-118.68{\mu}mol/g$ dry weight (DW). The highest total GSL amounts were documented in 'Hanra' ($146.02{\mu}mol/g$ DW) under light condition and 'Mokpo No. 68' ($86.67{\mu}mol/g$ DW) in dark condition, whereas the lowest was in 'Tamra' (30.13 and $14.50{\mu}mol/g$ DW) in both conditions. The sum of aliphatic GSLs attributed > 80% in all varieties, except 'Tamra' (67.7% and 64.9% in dark and light conditions, respectively) in the total GSL accumulation. Indolyl GSLs were ranged $2.41-15.73{\mu}mol/g$ DW, accounted 2.78-33.6% of the total GSLs in rapeseed varieties. CONCLUSION(S): These results provide valuable information regarding potential beneficial GSL contents individually. This study attempts to contribute to knowledge of the nutritional properties of the different varieties of rapeseed plants. These results may be useful for the evaluation of dietary information.

• 셀메드
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• 제4권1호
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• pp.5.1-5.8
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• 2014

Healthcare-associated infection represents a frequent cause of mortality that increases hospital costs. Due to increasing microbial resistance to antibiotics, it is necessary to search for alternative therapies. Consequently, novel alternatives for the control of resistant microorganisms have been studied. Among them, plant antimicrobial protein presents enormous potential, with flowers being a new source of antimicrobial molecules. In this work, the antimicrobial activity of protein-rich fractions from flower tissues from 18 different species was evaluated against several human pathogenic bacteria. The results showed that protein-rich fractions of 12 species were able to control bacterial development. Due its broad inhibition spectrum and high antibacterial activity, the protein-rich fraction of Hibiscus rosa-sinensis was subjected to DEAE-Sepharose chromatography, yielding a retained fraction and a non-retained fraction. The retained fraction inhibits 29.5% of Klebsiella pneumoniae growth, and the non-retained fraction showed 31.5% of growth inhibition against the same bacteria. The protein profile of the chromatography fractions was analyzed by using SDS-PAGE, revealing the presence of two major protein bands in the retained fraction, of 20 and 15 kDa. The results indicate that medicinal plants have the biotechnological potential to increase knowledge about antimicrobial protein structure and action mechanisms, assisting in the rational design of antimicrobial compounds for the development of new antibiotic drugs.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제26권2호
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• pp.87-94
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• 1988

Kim et at.(1986)은 유구낭미충 낭액을 감작시켜 만든 단세포군 항체를 CNBr활성화 Sepharose 4B에 연결시켜 친화성 크로마토그래피를 실시하고 낭액에서 A-항원을 분리한 바 있다. 이 연구는 그 항원 단백질의 생화학적 성상을 관찰한 것이다. Disc-PAGE에 의해 4.5~10% 폴리아크릴아마이드 젤에서 나타내는 Rf간을 기초로 분자량을 측정한 결과 A 항원의 분자량은 150,000 dalton이었다. A-항원은 SDS-PAGE에서 15,000, 10,000, 7,000 dalton에 해당하는 polypeptide로 분획이 구별되었다. 10% 2-mcrcaptoethanol로 처리하지 않거나 $95^{\circ}C$에서 5분간 처리하지 않은 A-항원의 SDS-PAGE에서는 7,000 dalton의 polypeptide가 분리되지 않았다. A-항원의 등전점(PI)은 pH6.8이었다. 낭액항원의 각 분획에 반응하는 항체를 갖는 환자혈청으로 A-항원을 SDS-PAGE/EITB한 바 환자혈청은 15,000, 10,000, 7,000 dalton에 해당하는 부위에서만 반응하였다. 낭액 단백질의 약70%를 차지하는 A-항원은 면역학적으로 내열성을 가졌으며 포충(hydatid cyst) 낭액 항원중 Oriol et at.(1971)의 "Antigen B"와 생화학적 성상이 비슷한 단백질이었다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제25권4호
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• pp.659-664
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• 1996

밀감 가공부산물에서 추출한 펙틴의 특성을 조사한 결과 알콜불용성 고형물(ASS)의 함량은 albedo층이 18.1%로 가장 높고, pulp가 5.7%로 가장 낮았다. AIS 구성 다당류 중 펙틴은 pulp와 albedo층이 각각 40.5% 및 35.2%로 구성되어 있어 펙틴 추출용으로서 좋은 소재인 것으로 나타났다. 총 펙틴 함량은 부위에 따른 큰 차이를 보이지 않아 대체로 AIS에 대해 30% 내외 이었으나, 가용성 펙틴 중 염산 가용성 펙틴의 경우에는 flavedo층이 14.0%로 가장 높고, pulp가 4.4%로 가장 낮았으며, 염류 가용성 펙틴의 경우에는 pulp부위가 15%임 에 비해 과피는 7% 정도로서 부위에 따른 차이가 나타났다. 0.05N-HCI을 사용하여 $85^{\circ}C의$ 열탕에서 펙틴을 추출한 결과 60분의 가열처리로 90%이상의 펙틴이 용출되었으며, microwave의 경우 5분간 2회 조사시킴에 의해 90% 정도 추출되었으나 부위별에 따른 차이는 크지 않았고, 이들 펙틴의 에스테르화도에 있어서는 microwave 처리구의 것이 다소 높은 값을 나타내었다. 추출 펙틴의 중성 당 조성을 조사한 결과 rhamnose, arabinose, galactose, glucose 및 xylose로 구성되고 있고, 이중 galactose가 60~78% 정도를 차지한 반면 xylose는 5% 이하이었다. 펙틴의 분자량 분포를 Sepharose CL-4B를 이용, gel permeation chromatography로 조사한 결과 부위별에 따른 큰 차이는 보이지 않았으나 pulp의 경우 분리 피크가 2개로 나타나 pulp를 구성하는 펙틴은 분자량이 높은 것과 이보다 낮은 두 group으로 구성되어져 있음을 알 수 있었다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제32권5호
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• pp.752-757
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• 2003

홍삼으로부터 홍삼알콜 추출물을 제조하고 부산물로 생성된 홍삼추출잔사로부터 한외 여과를 이용하여 홍삼산성다당체(RGAP, red ginseng acidic polysaccharide)를 대량으로 분리할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 방법으로 홍삼추출잔사로부터 분리된 RGAP의 수율은 20.9%이었고, RGAP로부터 지표성분인 활성성분(GFP)의 분리수율은 39.4%이었다. 분리된 RGAP는 macrophage에 의한 NO(nitric oxide)를 생성하여 암세포를 사멸시키는 것으로 나타났다. RGAP를 BALB/c 마우스에 복강투여한 후 분리된 복강 macrophage를 P815 암세포(mastocytoma)와 함께 배양하였을 때 배지내의 NO 농도는 대조군에서 4.3 $\mu\textrm{m}$이었으나, RGAP 100, 300 mg/kg 투여군에서는 각각 9.8 및 25.3$\mu\textrm{m}$로 증가하는 경향을 나타내었다. 아울러 암세포인 P8l5세포의 사멸율도 정상대조군일 경우 7.3%이었으나 RGAP 100, 300 mg/kg 투여군에서는 각각 22.7 및 31.8%로 증가하는 경향을 나타내었다. RGAP을 2M의 TFA로 10$0^{\circ}C$에서 1시간 가수분해한 후 당 표준품과 TLC로 비교한 결과 당 표준품과 Rf치 및 발색 색깔이 일치하는 4개의 spot, 즉 rhamnose(Rf 0.78, 노란색 ), glucose(Rf 0.61, 녹색), galactose(Rf 0.56, 녹색), glucuronic acid(Rf 0.36, 황갈색)를 관찰할 수 있었다. 가수분해된 RGAP 분해산물을 Gl(glucose)부터 G7(maltoheptaose)까지의 당류와 함께 TLC를 행한 결과 진한 색상을 나타내는 spot은 Rf 0.56~0.61로 G2(maltose, Rf 0.46) 이상의 단당류(monosaccharide)인 것으로 나타났다. RGAP의 일부 이화학적 특성을 조사한 결과 pH는 4.74, 건조감량은 4.72%, 조단백질 함량은 3.30%, 회분은 4.74%이었고 중금속인 Pb는 2.30 ppm이었다.

• 대한의생명과학회지
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• 제2권1호
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• pp.41-48
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• 1996

환자의 복수와 늑막액으로부터 p-diazonium phenylphosphorylcholine(DPPC) coupled Separose-4B affinity chromatography와 hydroxylapatite chromatography를 실시하여 C-reactive protein (CRP)를 분리, 정제하였다. 정제된 CRP를 토끼에게 면역화하여 항혈청을 얻고 affinity chromatography를 하여 면역항체(IgG)를 분리하였다. 분리된 면역항체를 미립자에 감작시킨 후 미립자 응집반응에 의하여 3분내에 CRP를 측정할 수 있는 간이 면역 측정법을 개발하였다. 본 연구에서 개발된 CRP측정법의 검출범위는 0.5~20mg/㎗이며, 임상 시험 결과 0.7~2.9mg/㎗에서는 강한 응집 반응을, 5.O~l3.2mg/㎗에서는 약한 응집반응을 보였고 28mg/dl이상에서는 항원 과잉으로 인한(zone of Ag excess phenomenon) 위음성을 나타냈다. 74명의 환자 혈청을 대상으로 CRP의 농도를 조사한 결과 평균치는 3.8mg/dl이었으며 대부분의 환자에서는 10mg/dl 이하의 농도로 존재하였다. 그러므로 1차 판정시 음성을 나타낸 시료라도 혈청을 5~10배정도 희석하여 재분석한다면 오차없이 CRP 를 검출할 수 있었다. 환자 혈청을 검체로 하여 본 연구에서 개발한 면역측정법과 현재 수입 시판 중인 프랑스의 B사 제품과 일본의 I사 제품을 비교한 결과 좋은 상관관계를 보였다. 이와 같은 평가 분석을 통하여 볼 때 본 연구에서 개발한 간이 면역 측정법은 사용이 비교적 간편하며 신빙성이 있어 CRP를 스크리닝하는데 효과적임을 알 수 있었다.

• 한국응용약물학회:학술대회논문집
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• 한국응용약물학회 1997년도 춘계학술대회
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• pp.95-95
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• 1997

Among the various receptor molecules discovered so far the ${\beta}$2-adrenergic receptors have been regarded as excellent model systems for the so called 7 transmembrane helix receptor and have been the focus of extensive studies. For the analysis of receptor structure and function a monoclonal antibody plays a crucial role, thus providing useful tools for the study of receptor. However, because of the minute quantity of receptor molecules which could be obtained from natural sources, the generation of specific monoclonal antibody against receptor molecules from the purified receptors has been regarded as virtually impractical in consideration of cost and experimental times. The purpose of the present study was to generate and characterize a monoclonal antibody against human ${\beta}$2-adrenergic receptor. For the production of antibody, C-terminal regions of the human ${\beta}$2-adrenergic receptor was produced as a fusion protein with Glutathion S-transferase (GST) in E. Coli. The expression of the fusion protein was identified by SDS-PAGE and Western blot using monoclonal anti-GST antibody. The fusion protein was purified to an apparent homogeniety by affinity chromatography with Glutathion Sepharose CL-4B and used as an antigen for the immunization of BALB/C mice. The Production of monoclonal antibody was achieved by fusion of the immunized spleen cells and SP/2-0 myeloma cells. Positive hybridomas were screened by ELISA and were cloned by two consecutive rounds of limiting dilution. The monoclonal antibody produced in this study (mAb${\beta}$C02) was IgM type and purified by immunoaffinity chromatography using anti-mouse IgM agarose as an affinity matrix. MAb${\beta}$C02 showed strong and specific immunoreactivity against both the fusion protein and human ${\beta}$2-adrenergic receptor in ELISA and Western blot. The molecular weight of immunoreactive band was 64 kDa and exactly coincided with the previously reported molecular weight of ${\beta}$2-adrenergic recepters. The results of the present study suggest that mAb${\beta}$C02 may be used for the study of receptor function and regulation in normal or nonphysiological status.

• Journal of Pharmaceutical Investigation
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• 제40권3호
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• pp.175-180
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• 2010

Albumin-modification has been viewed as one of the most effective ways of extending the short in vivo lifetimes of peptide drugs by delaying glomerular filtration. In this study, we describe a new type 2 anti-diabetic exendin-4 (Ex4) peptide derivative with significant binding ability to human serum albumin (HSA). This exendin-4 derivative consists of a 4-branched polyethylene glycol $(PEG)_{5k}$ (Mw: 20 kDa) modified with three stearylamines ($C_{18}-NH_2$) and one exendin-4 on its branches. PEG and stearylamine were selected to provide functionality to increase molecular size and bind to albumin, respectively. This derivative ($3C_{18}-4PEG_{5k}$-Ex4) was shown to have larger molecular size (Ca. 152 kDa) than actual (25.0 kDa) when subjected to size-exclusion chromatography, and the fluorescein-tagged $3C_{18}-4PEG_{5k}$-Ex4 displayed significant binding to the HSA-immobilized Sepharose CL-4B resin using confocal laser scanning microscopy. Furthermore, $3C_{18}-4PEG_{5k}$-Ex4 was found to have acceptable anti-hyperglycemic efficacy via three consecutive oral glucose tolerance testings (OGTT) in fasted type 2 diabetic db/db mice. The $HD_{total}$ value ($57.6{\pm}12.3%$) of $3C_{18}-4PEG_{5k}$-Ex4 at a 50 nmol/kg dose was 2-fold greater than that ($31.0{\pm}8.7%$) of native exendin-4 in non-fasted db/db mice. Especially, the blood glucose levels in the mice group treated with $3C_{18}-4PEG_{5k}$-Ex4 did not rebound to ~150 mg/dL until 24 h after the injection, which obviously shows the extended hypoglycemia. We believe that this derivative has great pharmaceutical potential as a novel long-acting type 2 anti-diabetic injection treatment.