• 원예과학기술지
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• 제28권3호
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• pp.442-448
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• 2010

본 연구는 gene tagging system(plasmid rescue와 inverse polymerase chain reaction)을 사용하여 얻은 배추($Brassica$ $rapa$ ssp. $pekinensis$) 형질전환체 계통을 분석하고 이들의 표현형을 관찰하고자 수행되었다. 배추의 기능유전체 연구를 위해 $Agrobacterium$의 전이 DNA(T-DNA)를 사용하여 삽입돌연변이체를 유기하였다. 형질전환체는 '서울' 배추 품종의 pRCV2 vector를 가진 $Agrobacterium$ $tumefaciens$을 접종하여 얻었다. 형질전환 $T_1$ 세대는 비형질전환체와 비교하여, 수술 수의 감소, 크거나 작은 꽃, 직립생장형, 잎에 털이 없는 것, 잎의 황백화 현상, 잎이 좁거나 결각이 깊은 것과 같은 다양한 표현형을 보였다. 형질전환 계통 중에서 발견된 13개의 돌연변이 계통의 표현형 변화는 체세포의 배수성 분석을 통하여 염색체 수의 변화에 기인하지 않은 것을 확인하였다. 배추 genomic DNA에서 T-DNA의 위치 확인을 위해 multiple copy와 single copy 형질전환체에 plasmid rescue와 inverse PCR 방법을 각각 적용하였다. 비형질전환체와 비교하여 뚜렷한 표현형적 차이를 보이고 Southern blot 분석 결과 1 copy의 T-DNA를 가지며 염색체 수가 20(2n)인 돌연변이체를 선발하여, flanking DNA 염기서열을 확인하고 배추 염색체내에서 각각의 유전자좌를 표시하였으며 이들 계통들에 대하여 데이터베이스를 작성 중에 있다.

• Plant Biotechnology Reports
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• 제4권3호
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• pp.201-211
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• 2010

We present a highly effective T-DNA inserted gene screening method as part of a reverse genetics model system using the Chinese cabbage (Brassica rapa L. spp. pekinensis). Three-step two-dimensional (2D) matrix strategies are potentially accurate and useful for the identification of specific T-DNA inserted mutants from a large population. To construct our Chinese cabbage model, we utilized a forward genetics screening approach for the abnormal phenotypes that were obtained from transgenic plants of Brassica rapa generated with Agrobacteria tumefaciens containing the pRCV2 vector. From one transgenic plant with an abnormal phenotype, we observed that the st1 gene (which is related to senescence-associated process proteins) contained a T-DNA fragment, and that its expression level was decreased. This T-DNA insert was then used as a control to construct an effective screening pool. As a result, the optimum template concentration was found to be 0.1-1 ng in our PCR strategy. For other conditions, positive changes to the Gibbs free energy prevented the formation of oligo dimers and hairpin loop structures, and autosegment extension gave better results for long fragment amplification. Using this effective reverse genetics screening method, only 23 PCR reactions were necessary to select a target gene from a pool of 100 individual DNAs. Finally, we also confirmed that the sequence we obtained from the above method was identical to the flanking sequence isolated by rescue cloning.

• 생명과학회지
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• 제11권5호
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• pp.423-431
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• 2001

Agrobacterium에 의한 식물형질전환은 가장 일반적으로 많은 사용되는 식물형질전환 기술이냐 이 과정에서 관여하는 식물 유전자들에 대한 관여하는 식물 유전자들에게 대한 연구는 거의 전무한 상태다. 본 연구는 Agrobacterium의 감염에 저항성을 보이는 새로운 돌연변이들의 분리와 분석 연구에 연속하여 Agrobacterium에 의한 식물형질전환에 관여하는 Arabidopsis RAT3 유전자의 cDNA와 gemonic clone을 plasmid rescue 기술을 이용하여 분리하였다. 염기서열 분석결과, 매우 유사한 2개의 유전자가 (RAT3-1과 RAT3-2)약 600bp 간격을 두고 연속하여 존재함을 밝혔다. 그중 RAT3-1 이 mutagen으로 사용된 T-DNA에 의해 손상을 받아 rat3 돌연변이 형질이 유도되었다. RAT3 유전자의 단백질의 분자량은 15 kDa 정도이며 아미노 밀단에 분비를 위한 signal peptide를 가지며 단백질이 전체적인 매우 친수성인 것으로 미루어 세포막 밖으로 분비될 것으로 생각된다. 이들 유전자의 정확한 생물학적 기능에 대한 연구들이 수행 중이며, 이러한 기초연구는 식물형질전환 기술의 개발에 기여할 것이다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제47권4호
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• pp.667-672
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• 2019

본 연구는 출아효모 Saccharomyces cerevisiae을 이용해 이종 유전자(heterologous gene)를 효모염색체내에 도입하여 안정적으로 발현하기 위한 시스템의 비교에 대해서 연구하였다. 반복적으로 사용할 수 있는 Cre/loxP system의 이용을 위해 C. glabrata 유래 유전자를 선택마커로 사용하였고, universal pRS-CMT vector를 이용한 4종의 유전자(XYLP, XYLB, GRE3 및 XYL2 유전자)를 모델 유전자로 cloning하였다. 구축된 pRS-XylP, pRS-XylB, pRS-Gre3 및 pRS-Xyl2 plasmid를 이용한 4번의 sequential integration을 통해 효모염색체내에 도입된 4종의 유전자를 순차적으로 발현시킬 수 있었다. 또한 4종의 유전자 발현 cassette를 동시에 가지는 pRS-PBG2 plasmid에 의한 one-step integration을 통해서, 도입될 유전자들의 순서를 정할 수 있었으며 각 유전자들의 동시발현을 안정적으로 유지할 수 있었다. 결론적으로 본 연구에서 사용한 4종의 유전자들의 염색체내 동시 integration 및 발현을 위해서는 one-step integration이 효과적임을 확인하였으며, 적절한 유전자 도입방법을 통해 산업적으로 유용한 생물시스템의 손쉬운 육종이 가능하리라 기대한다.

• 한국수산과학회지
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• 제30권1호
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• pp.46-54
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• 1997

분열효모 S. pombe의 포자형성은 배지상의 질소원의 고갈에 의하여 유도되어진다. 감수분열로부터 포자형성에 도달하는 과정에는 다수의 특이적인 유전자가 기능을 하고 있다. 본 연구에서는, 전포자막 구축에 필수적인 유전자 spo 5의 발현조절과 유전자의 메커니즘에 관하여 조사하였다. spo 5 유전자를 보유하는 약 5kb의 Hind III DNA 단편을 cloning 하였다. 이 단편으로부터 제한효소지도를 작성하여 얻어진 DNA 단편을 probe로 하여, RNA blot-hybridization를 이행하였다. 이 결과, 최소배지의 hetro matting-type 균주 (CD16-1)로 부터 조제한 mRNA가 검출되었다. 그리고 이 전사산물을 전사레밸에서 해석하기 위하여, homo matting-type (CD16-3) 균주를 질소원이 함유되지 않은 포자형성배지에서 배양한 후, 동일한 방법으로 mRNA를 조제하여 Northern hybridization으로 조사하였다. 그 결과, 이들 세포에서는 3.2kb에서만 전사산물이 검출되었으며, 2.5kb의 mRNA는 검출되지 않았다. 이상의 결과로 부터 spo 5 유전자를 coding하는 전사산물인 2.5kb의 mRNA는 질소원의 고갈된 상태하에서, 접합형 유전자좌의 hetro 접합성을 요구하는 것으로 입증하였다. spo 5 유전자의 전사발현은 질소원이 결핍과 접합형 유전자좌의 구성에 따른 환경요인과 유전적 요인에 의해서 제어되어지고 있다는 것을 입증하였다.

• 한국식품영양학회지
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• 제15권2호
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• pp.112-118
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• 2002

분열효모 S. pombe의 포자형성은 배지상의 질소원 고갈에 의해 유도되어지며 감수분열로부터 포자형성에 도달하는 과정에는 다수의 특이적인 유전자들이 관여하고 있다. 본 실험에서는 S. pombe genomic library 형질 전환법으로 spo5 유전자를 상보하는 clone을 screening한 후, sport 유전자를 단리하였다$^{8)}$ . 전포자막 구축에 필수적인 sport 유전자를 보유하는 약 5kb의 DNA 단편을 대장균, 효모 shuttle vector pTB248'의 Hind III 부위에 subclonning하였다. 그리고 이 DNA단편으로부터 제한 효소 지도를 작성하여(Fig. 2), spo5 변이체의 상보 능력을 조사하였다 (Fig. 3). 결과에서 서술한 바와 같이 상보능력은 동일하였으며, 이러한 상보성 실험 결과로부터 삽입된 단편상의 유전자 발현은 벡터의 promoter로부터 전사가 일어나는 것이 아니라, 삽입 단편상의 효모 고유의 promoter 에 의해서 전사가 일어나는 것으로 확인되었다. 따라서 clone화 한 DNA 단편 배열상에는 변역영역뿐만 아니라 promoter 영역이 포함된 것으로 판단되었다. 결실변이 도입 해석으로부터, spo5 유전자는 Sma I 부터 Hind m의 3kb 영역에 존재하였고 (Fig. 3), Nor-thern분석에 의해서 spo5 유전자의 전사를 조사한 결과, spo5 -mRNA는 Sma I 부터 Hind III 의 3kb 영 역에서 약2.5kb 크기로 검출되었다. 이 단편의 유전해석으로 부터 약 2.5kb의 전사산물은 최대 800개의 아미노산 잔기를 code하는 단백질로 판단되었다(Fig. 4). 그리고, Northern 분석법에 의해서 spo5 유전자의 전사를 조사한 결과, 서술한 바와 같이, 이 유전자는 질소기아 조건하에서만 유전자가 발현되는 것을 확인하였다(Fig. 4-2.5kb 단편).었다. 그리고 Edman법으로 결정한 PPIase의 39아미노산 잔기가 이 배열내에 완전히 보존되어 있었다. 이 결과로부터 이 ORF는PPIase구조 유전자의 1/3에 해당하는 단편임을 확인하였다. training system to a dangerous work like as "Interruption-free live-line work exchanging COS(Cut-Out-Switch)". In this program, the user works with a instruction on the window and speaker and can't work other tasks until each part of the task completed. The workers using this system can use their hands and viewpoint movement as he is in a real environment but the trainee can't use all parts and senses of a real body with the current VR technology. Despite of this weak point, when we consider the trends of improvement in electrical devices and communication technology, we can say that 3D graphic VR application has a high potentiality.) 야생화 초지(NWP, IWP)는 관행 혼파초지나 하번초 혼파초지에 비하여 동물상이 다양하고 많게 분포되었으며 그중 외국산 야생화초지의 동물 개체수가 가장 많게 나타났다. 이상의 결과를 종합할 때, 야생화 초지는 봄부터 가을까지 야생화가 지속되었고, 양서류 및 곤충의 개체 수가 증가되었던 것으로 보아 야생화 초지의 공익적인 측면에서의 활용 가능성도 클 것으로 기대된다