• 미생물학회지
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• 제49권1호
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• pp.1-7
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• 2013

유전자 재조합체는 상동염색체간의 예정된 DNA 가닥 전이와 교환이 이루어지는 상동염색체 재조합 과정에 의하여 생성된다. 이 재조합 경로는 DNA 이중 가닥 절단(double-strand breaks, DSBs)에 의해서 개시되며, 전이 과정의 중간단계에서 DNA의 구조적 변이 중간체인 단일 가닥 침투(single-end invasions, SEIs)와 이중 홀리데이 접합(double-Holliday junctions, dHJs)이 형성되어 교차성(crossover, CO) 혹은 비교차성(non-crossover, NCO) 결과물이 만들어진다. 본 연구는 이중 가닥 절단, 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합과 같은 재조합 중간체와 재조합 결과물의 구조분석에 초점을 두고, 이를 출아효모에서 인위적으로 이중 가닥 절단을 발생시킬 수 있는 HIS4LEU2 "hot spot" 을 이용한 물리적 분석방법으로 감수분열 재조합 중간체를 규명하였다. 물리적 분석을 위하여 동조화 된 세포에 감수분열을 유도한 후 hot spot 자리를 인식하는 제한효소를 처리하면, 재조합 중간체를 형성하고 있는 DNA 단편들을 Southern 분석법을 통해 탐지 및 정량 할 수 있다. 본 연구는 이 시스템으로 감수분열에서 이중가닥 절단으로부터 기인하는 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합 그리고 교차성/비교차성 재조합체로 전이되는 DNA의 구조 다형을 분석할 수 있음을 제시한다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권4호
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• pp.322-328
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• 2003

TAR(Transformation-Associated Recombination) cloning 법은 복잡한 고등생물의 게놈으로부터 유전자나 특정 염색체 부위를 선별적 분리를 가능하게 한다. 이 방법은 목적으로 하는 염색체 부위의 주변에 존재하는 비교적 짧은 게놈 염기서열에 대한 정보를 필요로 하며, spheroplast 형질전환 과정에서 게놈 DNA와 5'-와 3'-표적배열을 지닌 TAR vector 사이에서 일어나는 상동성 재조합과정에 의해 이루어진다. 본 연구에서는 single-copy 유전자의 클론닝에 필요한 specific hook의 최소 크기를 조사하였고, 서로 다른 TAR vector(radial과 unique vector)의 유용성을 조사하기 위해 동일한 single-copy 유전자의 클론닝을 통해 비교하였다. 그 결과, hHPRT 유전자에 대한 TAR cloning의 빈도는 hook의 길이가 750 bp∼63 bp의 범위에서 동일하게 나타났다. radial hook을 사용한 경우보다 unique hook을 사용하였을 경우 형질전환체의 수는 약 20배정도의 감소를 보였으나 목적으로 하는 재조합체의 분리 빈도는 두 배 이상 증가하였다. 그러므로 본 연구에서 two-unique TAR vector는 선별력이 높으므로 일반적 TAR cloning에 사용할 수 있으며, radial TAR vector의 경우는 병리학적 표본과 같이 제한된 게놈 DNA를 사용하는 경우에 더 적합하다고 볼 수 있다. 또한, single-copy 유전자의 분리에 필요로 하는 specific hoot의 최소 길이는 약 60 bp로도 가능하다는 것을 확인하였다.

• Molecules and Cells
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• 제25권3호
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• pp.417-427
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• 2008

Comparison of maps and QTLs between populations may provide us with a better understanding of molecular maps and the inheritance of traits. We developed and used two reciprocal $BC_1F_1$ populations, IP/DS//IP and IP/DS//DS, for QTL analysis. DS (Dasanbyeo) is a Korean tongil-type cultivar (derived from an indica x japonica cross and similar to indica in its genetic make-up) and IP (Ilpumbyeo) is a Korean japonica cultivar. We constructed two molecular linkage maps corresponding to each backcross population using 196 markers for each map. The length of each chromosome was longer in the IP/DS//IP population than in the IP/DS//DS population, indicating that more recombinants were produced in the IP/DS//IP population. Distorted segregation was observed for 44 and 19 marker loci for the IP/DS//IP and IP/DS//DS populations, respectively; these were mostly skewed in favor of the indica alleles. A total of 36 main effect QTLs (M-QTLs) and 15 digenic epistatic interactions (E-QTLs) were detected for the seven traits investigated. The phenotypic variation explained (PVE) by M-QTLs ranged from 3.4% to 88.2%. Total PVE of the M-QTLs for each trait was significantly higher than that of the E-QTLs. The total number of M-QTLs identified in the IP/DS//IP population was higher than in the IP/DS//DS population. However, the total PVE by the M-QTLs and E-QTLs together for each trait was similar in the two populations, suggesting that the two $BC_1F_1$ populations are equally useful for QTL analysis. Maps and QTLs in the two populations were compared. Eleven new QTLs were identified for SN, SF, GL, and GW in this study, and they will be valuable in marker-assisted selection, particularly for improving grain traits in tongil-type varieties.

• 미생물학회지
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• 제26권3호
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• pp.188-196
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• 1988

유당함유 울질로부터 알코올을 생산하기 위해 Saccharomyces cerevisiae X 2180-1 A, Candida pseudotropicalis ATCC 8619와 CBS 607 사이에 속간 및 종내 원형질체 융합을 시도하였다. S. cerevisiae X2180-1A(ade rho)와 C. pseudotropicalis CBS 607 (his met)간의 속간 융합율은 $1.0\times 10^{-5}$ C. pseudotropicalis ATCC 8619와 CBS 607 사이의 종내 융합율은 $3.9\times 10^{-6}$ - $1.0\times 10^{-4}$ 이었다. 이는 bovme serum albumin, myoinositol 그리고 ergosterol을 처리하지 않고 얻어진 원형질체 융합율과 비교해서 약 2-3.5배의 증가를 보여 이들 화합물이 속간 및 종내 융합을 증진시킨 것으로 사료된다. DNA 함량, 핵염색, UV 조사에 따른 생존력 비교 그리고 형질분리 후 교잡형 출현 등을 통해서 속간 (S. cerevisiae와 C. pseudotropicalis)과 종내 ( C psemdotropica/is strains) 융합체에서 핵융합이 일어난 것을 알 수 있었다. 또한 양친형과 비교해서 알코올 생성능이 증가된 종내 융합체를 얻었다.

• 미생물학회지
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• 제41권4호
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• pp.239-245
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• 2005

Transformation-associated recombination (TAR) 클로닝 법은 복잡한 게놈으로부터 염색체 내의 특정부위나 유전자를 선택적으로 분리할 수 있다. 이 방법은 목적 유전자에 근접한 작은 게놈DNA 염기서열 정보를 필요로 한다. 이 기술은 효모의 spheroplast transformation을 시키는 동안 목적으로 하는 유전자의 5' 또는 3' 서열을 포함하고 있는 TAR vector와 게놈DNA사이에서 일어나는 상동성재조합에 의해 이루어진다. 본 연구에서는 plasmid 모델시스템을 이용하여 target hooks 내에 존재하는 비상동성 염기서 열이 상동성재조합에 미치는 영향을 조사하였다. plasmid에 존재하는HIS3유전자와 변형시킨 his3-TRP1-his3 단편 사이의 상동성재조합의 효율은 $Ura^+$ 형질전환체의 형질분석에 의해 이루어졌다. $Ura^+$ 형질전환체의 수는 7종류의 서로 달리 변형된 his3-TRP1-his3 단편들을 사용하였을 매 거의 동일하게 나타났다. 그러나 $Trp^+His^+$ positive recombinants의 빈도는 변형된 his3-TRP1-his3 단편 내에 비상동성 영역에 부정확한 간격을 지닐 때 현저한 감소를 나타내었다. 이러한 결과로서, 부정확한 간격이 target hook과 substrate DNA 사이에 일어나는 상동성재조합을 방해하는 것으로 사료된다. 그러므로 이종간의 상동유전자를 클로닝 할 때에는 target hook내의 비상동성 염기서열이 존재한다면 이것이 정확한 간격을 지니는지 여부를 중요란 요인으로 고려해야 한다.

• 한국작물학회지
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• 제66권2호
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• pp.130-137
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• 2021

본 실험은 지역 적응성 시험을 통한 도입 초당옥수수 자원의 농업 형질을 조사하고 혼합 선형 모형을 이용하여 조사 형질의 분산 구성요소를 추정하고 이를 통해 형질들의 유전력을 추정함으로써 신규 자원이 가진 육종재료로서의 가치를 평가하고, 이를 이용한 초당 옥수수 품종 육종 과정에서 선택할 수 있는 육종 및 선발 방법을 도모하고자 하였다. 1. 출웅기와 출사기를 제외한 모든 형질의 유전력은 낮게 추정되었는데 이러한 형질은 분산구성요소 중 유전분산이 낮게 추정되었다. 착수고율의 경우 품종과 지역 간의 유의한 상호작용효과로 인해 낮은 유전분산이 추정된 것으로 보인다. 2. 측정 형질의 낮은 유전력 추정치는 시험 재료가 모두 최신 상업용 품종이기 때문일 것으로 사료된다. 따라서 육종재료로서의 낮은 잠재력을 의미하는 것은 아니다. 3. 낮은 유전분산과 유의미한 상호작용 효과를 극복하고 선발 효율을 극대화 하기 위하여 교잡종의 직접적인 자가 수정을 통한 자식 계통 개발을 진행하기 보다 intermating을 통한 유전자 재조합을 먼저 유기하는 것이 바람직 할 것으로 보인다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권6호
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• pp.497-506
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• 1998

Bacillus thurintensis subsp. kurstaki HD1 살충성 단백질 ICP 유전자가 있는 NdeI 단편 3.856 kb를 클로닝하여 제조한 pHLN2-80(-) 클론이 pHLN1-80(-)에 비해서 대장균에서 ICP발현량이 과다발현되는 현상을 규명하고자 하였다. 본 연구에서는 상기의 pHLN2-80(+) 클론의 발현량을 조절하는 원인을 규명하기 위하여 ICP의 아미노산 서열은 변화되지 않는 범위 내에서 pHLN1-80(+) 클론에 있는 Plac프로모터와 ICP유전자 프로모터의 일부인 -80 bp프로모터의 염기서열, 전사 개시점과 종결부위의 변이가 ICP유전자발현에 미치는 영향을 조사하였다. pHLN1-80(+)에 5'-말단에 존재하는 -80 bp 프로모터만을 보유한 pHLNK-80 클론은 ICP 생산은 매우 저조하였다. Plac프로모터와 -80 bp 프로모터의 구조 골격을 일부 변이 시킨 pHLNF1-80클론의 ICP생산량은 pHLN2-80(-)가 생산한 양보다는 낮아서 과다발현이 안되었다. Plac프로모터 상류를 약 350bp을 제거하여 만든 클론 pHLND2-80의 ICP 생산량은 모클론인 pHLN2-80(-) 보다 매우 높게 과다발현 되었다. ICP 유전자의 과다발현 현상에 대한 전사 개시점과 전사종결 부위의 역할을 알아보기 위해서 -72bp ICP유전자프로모터를 갖는 클론 pHLD1-72는 재조합 클론 pHLN2-80(-)가 생산한 양보다 적은 양의 ICP을 생성하였고, 클론 pHLD2-72는 재조합 클론 pHLN2-80(-)보다 적은 ICP을 발현하여 과다 발현되었으며, 클론 pHLN2-72는 모클론인 pHLN2-80(-)보다 약간 높은 ICP 생산량을 보여 과다발현되었다. 클론 pHLN2-72를증식하여 파쇄액을 만든 후에 Bombyx mori유충에 대한 살충력 검사에서 클론 pHLN2-72이 생산한 ICP는 pHLN1-80(+)이 생산한 ICP보다 약 90배의 살충력을 보였다. SDS-PAGE와 Western blot 분석에서도 클론 pHLN2-72는 재조합 클론 pHLN2-80(-)보다 약간 높게 ICP가 생성이 되었었다. 이상의 결과는 과다발현에 Plac프로모터와 종결부위가 반드시 필요하며, -72 bp ICP 프로모터가 -80 bp 프로모터보다 과다발현률이 높았으며, ICP 유전자는 반드시 Plac프로모터의 전사 방향에 역방향으로 삽입이 되어야 하는 것으로 나타났다.

• 미생물학회지
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• 제52권4호
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• pp.455-462
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• 2016

Pseudomonas aeruginosa P-5 균주는 홀수개의 탄소수를 갖는 지방산으로부터 3-hydroxyvalerate (3HV)와 medium-chain-length (MCL) 3-hydroxyalkanoates (3HAs) 단위체로 구성된 popolyhydroxyalkanoate (PHA) 공중합체를 생산하는 특이한 성질을 갖고 있다. 이 균주가 갖고 있는 2개의 MCL-PHA synthases ($PhaC1_{P-5}$와 $PhaC2_{P-5}$)의 탄소길이에 따른 기질특이성을 비교하기 위하여 각각의 유전자를 PHA 생합성능이 결여된 돌연변이주 Pseudomonas putida GPp104에 도입하고 발현시킨 결과, $PhaC2_{P-5}$는 3HV와 MCL 3HAs로 이루어진 공중합체를 생산하지만 $PhaC1_{P-5}$는 단지 MCL 3HAs로 구성된 공중합체를 생산하였다. 이는 $PhaC2_{P-5}$가 $PhaC1_{P-5}$과는 달리 보다 짧은 탄소길이의 3-hydroxyvaleryl Co-A를 기질로 인지하여 합성반응에 이용할 수 있음을 보여주는 것이다. 또한 $PhaC2_{P-5}$의 효소활성 및 기질특이성의 변화를 유도하기 위하여 위치지정 돌연변이생성을 수행하고 P. putida GPp104과 다른 PHA 생합성능 결여 돌연변이주인 Ralstonia eutropha $PHB^-4$에서 발현시킨 결과, $PhaC2_{P-5}$ 내 두 개 아미노산의 치환(Ser326Thr과 Gln482Lys)이 공중합체의 3HV 함량을 크게 증진시키는 효과를 보였다. 두 개 아미노산이 모두 치환된 $PhaC2_{P-5}$ 유전자($phaC2_{P-5}QKST$)를 갖는 P. putida GPp104를 nonanoic acid가 탄소원으로 함유된 배지에서 배양하였을 때, 모균주에 비해 공중합체 함량과 공중합체 내 3HV 함량이 각각 2.5배 및 3.5배 증가하였다. 따라서 $phaC2_{P-5}QKST$를 포함하는 재조합 균주는 개량된 물성의 신규PHAs 생산에 유용할 것으로 기대된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권2호
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• pp.110-116
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• 2004

B. thuringiensis subsp. kurstaki HD1 살충성 결정체 단백질 icp 유전자를 클로닝하여 두개의 클론 pHLNl-80(＋) 및 pHLN2-80(－)을 제조하였으며, pHLNl-80(＋) 클론에는 icp 유전자의 전사개시부위가 정방향으로 클론이 되었고, 유전자 프로모터의 일부인 -80 bp를 가지고 있고, pHLN2-80(－) 클론은 핀자의 전사개시부위가 역방향으로 클로닝이 되었다. 상기 두 클론을 대장균에서 발현을 조사한 결과 icp 유전자가 역으로 삽입된 pHLN2-80(－) 클론은 pHLNl-80(＋)클론보다 ICP발현량이 현격히 증가하는 것을 확인하였다. pHLN2-80(－) 플라스미드에서의 -80 bp 프로모터에서 SD서열(-14 bp sequences) 상류부위를 제거한 후 동일한 살충성 결정체 단백질 icp 유전자의 과다발현 현상이 일어나는지 조사하기 위해 icp 유전자가 역방향으로 클로닝된 pHLRBSl-14와 icp 유전자가 정방향으로 클로닝된 pHLRBS2-14 클론을 제조하였다. 또한 상이한 클로닝 운반체에서도 과다 발현이 일어나는지를 보기위하여 pHLNl-80(＋)과 pHLN2-80(－) 플라스미드에서와 동일한 구조가 되도록 icp 유전자를 pUC18과 pUC19플라스미드에 각각 클로닝하여 pHLNUCl-80과 pHLNUC2-80 클론을 제조하였다. pHLRBSl-14과 pHLRBS2-14클론을 대장균에서 발현을 시킨 후에 파쇄하여 SDS-PAGE와 Western blot으로 분석을 한 결과는 클론 pHLRBSl-14는 클론 pHLRBS2-14보다 많은 양의 ICP를 생산하였고, pHLRBSl-14는 pHLN2-80(－) 클론 보다는 적게 ICP를 생산하였다. 이러한 발현 현상은 -80 bp promoter 에서 결실된 SD서열의 상류부위가 발현에 직접적인 영향을 주고 있다는 것을 의미한다. pHLNUC1-80이 역방향으로 클로닝된 pHLNUC2-80 클론보다 적게 ICP 의 발현을 하였다. 이 결과는 상기 클론이 icp 유전자 과다발현이 특정 클로닝 운반체에만 국한되어 일어나는 것이 아니며 유전자와 프로모터 간의 구조적 배열에 의하거나 프로모터에 있는 transcription-supressing regions이 교란되어서 일어난 것임을 시사한다. 그러나 왜 전사개기부위가 역삽입의 경우에 과다발현이 되는지 아직은 판단하기 어려우며 앞으로 더욱 연구를 계속하여야 할 과제로 남아있다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제30권3호
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• pp.439-445
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• 2017

Objective: Production of alpha-1,3-galactosyltransferase (${\alpha}GT$)-deficient pigs is essential to overcome xenograft rejection in pig-to-human xenotransplantation. However, the production of such pigs requires a great deal of cost, time, and labor. Heterozygous ${\alpha}GT$ knockout pigs should be bred at least for two generations to ultimately obtain homozygote progenies. The present study was conducted to produce ${\alpha}GT$-deficient miniature pigs in much reduced time using mitotic recombination in neonatal ear skin fibroblasts. Methods: Miniature pig fibroblasts were transfected with ${\alpha}GT$ gene-targeting vector. Resulting gene-targeted fibroblasts were used for nuclear transfer (NT) to produce heterozygous ${\alpha}GT$ gene-targeted piglets. Fibroblasts isolated from ear skin biopsies of these piglets were cultured for 6 to 8 passages to induce loss of heterozygosity (LOH) and treated with biotin-conjugated IB4 that binds to galactose-${\alpha}$-1,3-galactose, an epitope produced by ${\alpha}GT$. Using magnetic activated cell sorting, cells with monoallelic disruption of ${\alpha}GT$ were removed. Remaining cells with LOH carrying biallelic disruption of ${\alpha}GT$ were used for the second round NT to produce homozygous ${\alpha}GT$ gene-targeted piglets. Results: Monoallelic mutation of ${\alpha}GT$ gene was confirmed by polymerase chain reaction in fibroblasts. Using these cells as nuclear donors, three heterozygous ${\alpha}GT$ gene-targeted piglets were produced by NT. Fibroblasts were collected from ear skin biopsies of these piglets, and homozygosity was induced by LOH. The second round NT using these fibroblasts resulted in production of three homozygous ${\alpha}GT$ knockout piglets. Conclusion: The present study demonstrates that the time required for the production of ${\alpha}GT$-deficient miniature pigs could be reduced significantly by postnatal skin biopsies and subsequent selection of mitotic recombinants. Such procedure may be beneficial for the production of homozygote knockout animals, especially in species, such as pigs, that require a substantial length of time for breeding.