Microbiology and Biotechnology Letters (한국미생물·생명공학회지)

The Korean Society for Microbiology and Biotechnology (한국미생물·생명공학회)
권호 표지

Cloning and Expression of Bacillus thuringiensis crylAa1 Type Gene.

Bacillus thuringiensis crylAa1 Type Gene의 클로닝과 발현

  • 이형환 (건국대학교 이과대학 생명과학과) ;
  • 황성희 (건국대학교 이과대학 생명과학) ;
  • 권혁한 (건국대학교 이과대학 생명과학) ;
  • 안준호 (건국대학교 이과대학 생명과학) ;
  • 김혜연 (건국대학교 이과대학 생명과학) ;
  • 안성규 (건국대학교 이과대학 생명과학) ;
  • 박수일 (건국대학교 이과대학 생명과학과)
  • Published : 2004.06.01
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Abstract

The over-expression in E. coli of the pHLN1-SO(＋) and pHLN2-80(－) plasmids cloned an insecticidal crystal protein (ICP) gene (crylAal type) from Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD 1 was investigated through in part, the deletion of -80 bp promoter and an alternative change of cloning vector system. Two recombinant plasmids were constructed in an attempt to analyze the over-expression of the ICP in relations to its gene structure possessing only -14 bp ［Shine-Dalgarno (SD) sequence of -80 bp promoter］. Also, anther two recombinant plasmids similarly cloned the icp gene in a different vector system. The amounts of ICP produced from the recombinants were measured by SDS-PAGE and confirmed by Western blot analysis. One clone, pHLRBS1-14 clone in which only the SD sequence in the inverted orientation icp gene appeared, was more evident than the pHLRBS2-14 clone in which only the -14 bp SD sequence of the right orientated icp gene was shown to exist. The pHLN2-80(－) clone produced more ICP proteins than the pHLRBS1-14 clone. In the two clones, pHLNUC1-80 right-oriented icp gene and the pHLNUC2-80 clone inverted-orientation icp gene in a new different vector, the pHLNUC2-80 produced more ICP proteins in E. coli system. These results indicate that the P/ac promoter, the inverted icp gene insertion and -80 bp promoter (-66 bp part of the icp gene promoters), were concerned with the expression of the icp gene in the recombinant plasmids. In addition, the expression mechanism might result from the disruption of the transcription-suppressing regions in the promoter regions.

B. thuringiensis subsp. kurstaki HD1 살충성 결정체 단백질 icp 유전자를 클로닝하여 두개의 클론 pHLNl-80(＋) 및 pHLN2-80(－)을 제조하였으며, pHLNl-80(＋) 클론에는 icp 유전자의 전사개시부위가 정방향으로 클론이 되었고, 유전자 프로모터의 일부인 -80 bp를 가지고 있고, pHLN2-80(－) 클론은 핀자의 전사개시부위가 역방향으로 클로닝이 되었다. 상기 두 클론을 대장균에서 발현을 조사한 결과 icp 유전자가 역으로 삽입된 pHLN2-80(－) 클론은 pHLNl-80(＋)클론보다 ICP발현량이 현격히 증가하는 것을 확인하였다. pHLN2-80(－) 플라스미드에서의 -80 bp 프로모터에서 SD서열(-14 bp sequences) 상류부위를 제거한 후 동일한 살충성 결정체 단백질 icp 유전자의 과다발현 현상이 일어나는지 조사하기 위해 icp 유전자가 역방향으로 클로닝된 pHLRBSl-14와 icp 유전자가 정방향으로 클로닝된 pHLRBS2-14 클론을 제조하였다. 또한 상이한 클로닝 운반체에서도 과다 발현이 일어나는지를 보기위하여 pHLNl-80(＋)과 pHLN2-80(－) 플라스미드에서와 동일한 구조가 되도록 icp 유전자를 pUC18과 pUC19플라스미드에 각각 클로닝하여 pHLNUCl-80과 pHLNUC2-80 클론을 제조하였다. pHLRBSl-14과 pHLRBS2-14클론을 대장균에서 발현을 시킨 후에 파쇄하여 SDS-PAGE와 Western blot으로 분석을 한 결과는 클론 pHLRBSl-14는 클론 pHLRBS2-14보다 많은 양의 ICP를 생산하였고, pHLRBSl-14는 pHLN2-80(－) 클론 보다는 적게 ICP를 생산하였다. 이러한 발현 현상은 -80 bp promoter 에서 결실된 SD서열의 상류부위가 발현에 직접적인 영향을 주고 있다는 것을 의미한다. pHLNUC1-80이 역방향으로 클로닝된 pHLNUC2-80 클론보다 적게 ICP 의 발현을 하였다. 이 결과는 상기 클론이 icp 유전자 과다발현이 특정 클로닝 운반체에만 국한되어 일어나는 것이 아니며 유전자와 프로모터 간의 구조적 배열에 의하거나 프로모터에 있는 transcription-supressing regions이 교란되어서 일어난 것임을 시사한다. 그러나 왜 전사개기부위가 역삽입의 경우에 과다발현이 되는지 아직은 판단하기 어려우며 앞으로 더욱 연구를 계속하여야 할 과제로 남아있다.

Keywords

References

  1. J. Bacteriol. v.127 Electron microscope study of sporulation and parasporal crystal formation in Bacillus thuringiensis Bechtel, D. B.;L. A. Bulla, Jr.
  2. Nucleic Acids Res. v.7 A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA Birnboim, H. C.;J. Dolly https://doi.org/10.1093/nar/7.6.1513
  3. Protein Methods(2nd ed.) Bollag, D. A.;M. D. Rozycki;S. J. Edelstein
  4. The molecular biology of the Bacilli. v.Ⅱ The genetics and molecular biology of Bacillus thuringiensis Carlton, B. C.;J. M. Gonzales, Jr.;D. A. Dubnau(ed.)
  5. Microbial control of pests and plant diseases, 1970-1980 Insecticidal activity of isolates of Bacillus thuringiensis and their potential Dulmage, H. T.;Co-Operators;H. D. Burges(ed.)
  6. Plasmid v.5 Correlation between specific plasmids and δ-endotoxin production in Bacillus thuringiensis Gonzales, J. M. Jr.;H .T. Dulmage;B. C. Carlton https://doi.org/10.1016/0147-619X(81)90010-X
  7. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. v.79 Cloning and localization of the lepidopteran protoxin gene of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Held, G. A.;L. A. Bulla, Jr.;E. Ferrari;J. Hoch;A. I. Aronson;S. A. Minnich https://doi.org/10.1073/pnas.79.19.6065
  8. Kor. J. Microbiol. v.36 Overexpression of insecticidal protein gene of Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1 Hwang, S. H.;K. H. Yoo;E. S. Moon;S. C. Cha;H. H. Lee
  9. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.26 Formulation of a Bacillus thuringiensis strain NT0423 Kim, H. S.;J. Y. Roh;D. W.Lee;J. H. Chang;Y. H. Je;S. D. Woo;J. K. Kim;Y. M. Yu;S. K. Kwon
  10. EMBO J. v.7 Cloning and expression of the protein genes from Bacillus thuringiensis strain Berliner 1715 Klier, A.;F., Fergette;J. Ribier;G. Rapoport
  11. J. Bacteriol. v.154 Diversity of locations for Bacillus thuringiensis crystal protein genes Kronstad, J. W.;H. E. Schnepf;H. R. Whiteley
  12. Microbial and Viral Pesticides Kurstak, E.
  13. Kor. J. Appl Microbiol. Biotechnol. v.26 Formulations of Bacillus thuringiensis insecticides by liquid and semi-solid fermentations Lee, H. H.
  14. J. Kor. Soc. Virol. v.20 Restriction map of the genome of Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus Lee, H. H.;H. J. Lee;K. H. Yoo
  15. J. Mol. Biol. v.53 Calcium dependent bacteriopphage DNA phage infection Mandel, M.;A. Higa
  16. Molecular cloning Maniatis, T.;E. F. Fritsch;J. Sambrook
  17. J. Appl. Environment. Microbial. v.50 Cloning and expression of an insecticidal k-73 type crystal protein gene from Bacillus thuringiensis var. kurstaki into Escherichia coli McLinden,J. H.;J. R. Sabourin;B. D. Clark;D. R. Gensler;W. E. Workman;H. D. Dean
  18. J. Bacteriol. v.27 Physiology of sporeforming bacteria association with insects: Minimal mutritional requirements for growth, sporulation, and parasporal crystal formation of Bacillus thuringiensis Nickerson, K. W.;L. A. Bulla, Jr.
  19. Kor. J. Appl. Microbiol. Bioeng. v.16 Immunological analysis of endotoxin proteins produced by Bacillus thuringiensis serovar. kurstaki HD1 and HD73 Oh, S. S.;Y. J. Lee;C. K. Kim;B. S. Koo;J. B. Kim;H. H. Lee
  20. Proc. Natl. Acad. Sci. USA v.78 Cloning an expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli Schnepf, E.;H. R. Whitely https://doi.org/10.1073/pnas.78.5.2893
  21. J. Biol. Chem. v.260 The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deduced from the DNA base sequence Schnepf, H. E.;H. C. Wong;H. R. Whitely
  22. J. Bacteriol. v.169 Expression of a cloned Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli Schneph, H. E.;H. C. Wong;H. R. Whitely https://doi.org/10.1128/jb.169.9.4110-4118.1987
  23. J. Microbiol. Biotechnol. v.11 Sequencing and baculovirus-based expression of the glycoprotein B2 gene of HSV-2(G) Uh, H. S.;J. K. Park;H. Kang;S. Y. Kim;H. H. Lee
  24. J. Biol. Chem. v.258 Transcriptional and translation start sites for the Bacillus thuringiensis crystal protein gene Wong, H. C.;H. E. Schneph;H. E. Whiteley
  25. Virus Research v.86 Enhanced protection against HSV lethal challenges in mice by immunization with a combined HSV-1 glycoprotein B:H:L gene DNAs Cha, S. C.;Y. S. Kim;J. K. Cho;J. Cho;S. Y. Kim;H. Kang;M. H. Cho;H. H. Lee https://doi.org/10.1016/S0168-1702(02)00037-0