• KSBB Journal
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• 제15권5호
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• pp.489-496
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• 2000

고농도 유전자 재조합 대장균을 이용하여 pyruvate dehy-drogenase complex-E2 특이성 인간 모노클론 항체의 Fab 부분을 효율적으로 생산하기 위해 회분식, 이단 연속식, 반 유 가식, two-stage cyclic fed-batch 동 여러 가지 배양 방법이 조사되었다. 먼저 플라스미드 안정성 문제를 극복하기 위해 growth stage와 production stage를 분리하는 two-phase 회분식 배양과 이단 연속식 시스템을 시도하였다 그 결과 two-phase 회분식 배양보다는 이단 연속식 배양에서의 세포농도와 항체 생산성이 우수하였다 또한 이단 연속식 배양에서의 세포 성 장과 항처l 생산성은 용존산소를 제어한 경우가 그렇지 않은 경우보다 월등하게 높았다. 그리고 plasmid 안정성에 있어서 는 실험기간 내에 거의 100%를 유지하여 높은 안정도를 보 여주었다. 유가식 공정에 적합한 공급 배지로 변형된 M9 배 지가 최적배지로 선정되었고 이 배지 중 최적의 CjN 비율을 조사한 결파 2:3으로 결정되었다. 반 유가식 시스템에서 constant feeding 전략을 사용할 경우 최적 공급속도는 $0.6g/\ell/hr$이었다. 또한 pulse에 의해 공급배지를 공급할 경우에는 총 공급 량이 같을 경우 소량으로 자주 공급해 주는 것이 공급배지를 한꺼번에 많은 양을 공급해주는 것 보다 바람직하였다. 여러 가지 feeding 전략을 조사해 본 결과 linear feeding 방법이 가장 효과적이었다. 하지만 linear feeding 방법마저도 고농도 세포배양에 한계가 있었기 때문에 pH-stat 방법을 이용한 two-stage cyclic fed-batch 시스템을 시도하여 $54 g/\ell$의 세포 를 얻을 수 있었다. 따라서 이 방법이 일단 생산성 향상을 위한 세포의 고농도 배양에는 조사한 여러 배양 시스템 중에 가장 효율적인 시스템임올 알 수 있었다 하지만 이 시스템 에서 포도당을 낮은 level로 유지할 수 있었으나, 초산의 과도한 축적으로 항체 생산성의 향상은 예상에 비해 크지 않았다.

• 농업과학연구
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• 제44권1호
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• pp.30-39
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• 2017

This study was performed to produce succinic acid from biomass by developing mutants of Cellulomonas flavigena in which the succinate dehydrogenase gene (sdh) is deleted. For development of succinate producing mutants, the upstream and downstream regions of sdh gene from C. flavigena and antibiotic resistance gene (neo, bla) were inserted into pKC1139, and the recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli ET12567/pUZ8002 which is a donor strain for conjugation. C. flavigena was conjugated with the transformed E. coli ET12567/pUZ8002 to induce the deletion of sdh in chromosome of this bacteria by double-crossover recombination. Two mutants (C. flavigena H-1 and H-2), in which sdh gene was deleted in the chromosome, were constructed and confirmed by PCR. To estimate the production of succinic acid by the two mutants when the culture broth was fermented with biomass such as CMC, xylan, locust gum, and rapeseed straw; the culture broth was analyzed by HPLC analysis. The succinic acid in the culture broth was not detected as a fermentation products of all biomass. One of the reasons for this may be the conversion of succinic acid to fumaric acid by sdh genes (Cfla_1014 - Cfla_1017 or Cfla_1916 - Cfla_1918) which remained in the chromosomal DNA of C. flavigena H-1 and H-2. The other reason could be the conversion of succinyl-CoA to other metabolites by enzymes related to the bypass pathway of TCA cycle.

• KSBB Journal
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• 제20권2호
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• pp.112-115
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• 2005

본 연구는 장시간의 산업적인 연속 배양에서 문제가 되는 플라즈미드 불안정성을 극복하기 위해서 박테리오 파아지람다를 벡터로 이용하였다. 또한, 벡터의 안정성과 생산성을 높이기 위해서 용균과 ${\lambda}DNA$패키징이 결핍된 돌연변이 람다를 선별하였다. 이 돌연변이 람다는 온도 전환에 의해서 단백질이 생산되는 온도 민감성 돌연변이 cI유전자를 가지고 있기 때문에 재조합 단백질 생산, ${\lambda}DNA$ 복제,숙주 세포의 안정성 등이 lytic상태로의 전환을 유도하는 온도에 영향을 받게 된다. $36^{\circ}C$의 배양 온도는 lytic으로 전환이 잘 되지 않았고, $40^{\circ}C$ 이상의 배양 온도는 완전한 lytic상태를 유도하였다. 그러나$42^{\circ}C$의 배양 온도에서는 생산성이 감소되는 온도 저해 효과가 관찰되었다. 온도가 증가할수록 박테리오 파아지가 들어 있지 않는 대장균의 수는 증가하였고,이것은 새로운 파아지를 만들 수 있는 박테리오 파이지를 사용하여 재감염을 시키면 완화될 수 있을 것으로 예상된다. 결과적으로 단위 세포당 발현량은 $40^{\circ}C$에서 최대를 나타내었고, 안정성이나 총 발현량의 관점에서는 $38^{\circ}C$가 최적의 온도로 관찰되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제28권10호
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• pp.1749-1759
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• 2018

Recombinant (rec) prion protein (PrP) is an extremely useful resource for studying protein misfolding and subsequent protein aggregation events. Here, we report mass production of high-purity rec-polypeptide encoding the C-terminal globular domain of PrP; (90-230) for human and (89-231) for murine PrP. These proteins were expressed as His-tagged fusion proteins in E. coli cultured by a high cell-density aerobic fermentation method. RecPrPs recovered from inclusion bodies were slowly refolded under reducing conditions. Purification was performed by a sequence of metal-affinity, cation-exchange, and reverse-phase chromatography. The current procedure yielded several dozens of milligrams of recPrP per liter with >95% purity. The purified recPrPs predominantly adopted an ${\alpha}$-helix-rich conformation and were functionally sufficient as substrates to measure the seeding activity of human and animal prions. Establishment of a procedure for high-level production of high-purity recPrP supports the advancement of in vitro investigations of PrP including diagnosis for prion diseases.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제30권3호
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• pp.206-209
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• 2002

Bacillus stearothermophilus의 CCTase 유전자(cgtS) 대장균과 효모의 shuttle vector로서 항구적 promoter인 adh l promoter를 함유한 pVT103-U(6.9Kb)에 도입하여 재조합 plasmid pVT-CCTS (9.0Kb)을 구축하고 효모 숙주 S. cerevisiae 2805에서 발현시켰다. 재조합 균주의 항구적 발현계인 2805/pv7-CGTS의 최적 발현조건은 YP배지에 dextrose 2%, pH 5.5, 30"C에서 최적 발효조건이었으며, CCTase의 최대 발현량은 48시간 배양시 0.624unit/mL을 나타내었다. B. stearothermophilus의 signal peptide가 재조합 효모에서도 높은 분비효율을 나타내어서 발현된 효소의 87%가 세포 외로 분비 생산되었다.산되었다.

• Korean Chemical Engineering Research
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• 제52권1호
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• pp.45-51
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• 2014

본 연구는 농업 부산물인 옥수수대(corn stover)를 이용하여 묽은 황산법(DSA; dilute sulfuric acid)과 암모니아 침지법(SAA; soaking in aqueous ammonia) 그리고 암모니아 재순환 침출법(ARP; ammonia recycle percolation)을 비교하여 각 전처리법의 특징과 장단점을 분석하였고, 동시당화공동발효를 통한 에탄올 생산을 비교하였다. ARP, DSA, SAA를 이용하여 전처리된 고형물(3% 글루칸 투입)을 15 FPU/g-glucan, 30 CBU/g-glucan의 상업용 효소(Spezyme CP와 Novozyme 188;)와 E. coli KO11 균주(ATCC$^{(R)}$ 55124)를 이용하여 동시당화공동발효를 수행하였다. 전처리 후에 남은 고형물에 있는 당의 최대이론적 에탄올 수율은 각각 87, 90 그리고 78%였다. 이것은 전처리되지 않은 원래 옥수수대의 총 당량(글루칸 +자일란) 대비 각각 69, 58, 및 74%에 해당하는 것으로 SAA의 수율이 가장 높게 관찰되었다. 또한 전처리 당화액을 이용한 동시당화공동발효 실험결과는 DSA의 당화액이 발효균주에 대하여 가장 높은 독성을 나타내었고 ARP 전처리 당화액이 그 다음으로 저해효과가 큰 것으로 나타났다. 결국 SAA를 이용하여 전처리한 후 리그닌이 풍부한 당화액은 이용하지 않고 전처리된 고형물과 동시당화공동발효 공정을 이용한 에탄올 생산이 가장 간단하면서 경제적인 공정으로 제안되었다.

• 미생물학회지
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• 제45권2호
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• pp.228-231
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• 2009

고추 역병을 야기하는 Phytophthora capsici 는 짧은 시간 내에 많은 면적에 피해를 주는 병으로 한번 발생하면 방제가 어려운 병으로 알려져 있다. 이러한 역병 곰팡이의 방제를 위하여 본 연구에서는 P. capsici의 염색체 복제 및 세포 골격 유지 등에 관여하는 단백질인 microtubule의 형성 저해를 유도하는 물질을 탐색하여 궁극적으로 고추역병 방제를 위한 연구를 진행하였다. 먼저 P. capsici alpha 및 beta tubulin을 E. coli BL21(DE3)에서 발현시켜 분리 정제하여 in vitro microtubule 형성을 확인하였다. P. capsici microtubule 형성 저해 metagenome clone 스크리닝을 위하여 경기도 수원의 여기산 토양에서 metagenome을 분리하여 library를 제작하여 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 방법을 이용하여 P. capsici microtubule 형성을 저해하는 화합물을 탐색하였다. In vitro 스크리닝에서 약 384개의 metagenome library에서 2종의 clone을 선택하여 고추작물에 직접 방제하여 역병균의 생장 억제를 확인하였다. 이는 차후 고추역병 방제제 개발에 있어 중요한 후보물질뿐만 아니라 metagenome library를 이용한 새로운 방법의 개발이라 사료 된다. 또한 in vitro 스크리닝에서 얻어진 2종의 metagenome clone의 염기서열을 분석하여 항역병 활성에 관련하는 DNA 서열을 확보하고 이를 응용하여 물질을 생산 할 경우, 현장에서 활용 할 수 있는 효과 큰 친환경 천연고추역병 방제제로서의 개발 가능성을 가진다는 점에서 본 연구결과는 매우 의미 있는 결과라 생각된다.