• 한국가축번식학회지
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• 제21권1호
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• pp.19-23
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• 1997

This present study was carried out to examine the effect of maturation media and liquid boar semen on in vitro maturation and feritilization of pig oocytes. The results obtained were as follows : When the oocytes were cultured for 36∼42 hours in mTCM-199, Waymouth MB 725/1 and mTLP-PVA medium, the maturation rates were 90%, 92% and 88%, respectively. The sperm penetration rates of pig oocyte matured in vitro were 87%(mTCM-199), 90%(Waymouth MB 725/1) and 86%(mTLP-PVA), respectively. The rates of nuclear maturation and fertilization of pig oocytes among three different media did not differ. However, the rate of male pronucleus formation of pig oocytes was significantly higher in pig oocytes matured in Waymouth MB 725/1(91%) than oocytes matured in mTCM-199(66%) and mTLP-PVA(62%) medium (P<0.05). When the collected sperm-rich fraction without diluent was used fro in vitro fertilization in mTCM-199 fertilization medium, the fertilization rate was 87.9%. However, when the liquid boar semen diluted with B tschwiler diluent was used at day 3 and 5 after dilution, the fertilization rate was 40.8% and 0.0%, respectively.

• 한국동물학회지
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• 제31권1호
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• pp.21-28
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• 1988

dbcAMP에 의해 성숙이 억제된 생쥐난자의 수정능을 조사하기 위해 본 실험을 행하였다. dbcAMP로 일시 성숙이 억제되었던 난자를 배양액내에서 정자와 섞고 24시간 배양한 후 발생한 2세포기의 배아형성, 정자의 관입, 전액형성을 조사하여 2세포기로 배아발생이 진척된 것을 수정율의 기준으로 정하였다. dbcAMP를 처리하지 않은 난자는 약 53.3%의 수정율을 보였으며,dbcAMP가 함유되 배양액에서 배양한 후 기본 배양액에서 성숙시킨 난자들의 수정율은 dbcAMP의 처리시간에 비례하여 낮으나, 정자의 관입은 정상적으로 일어났다. 전자현미경적 관찰에 의하면 dbcAMP 처리는 난자의 미세구조에 어떠한 변화도 야기하지 않았다. 따라서 dbcAMP를 사전처리하여 성숙을 억제한 난자라할지라도 어느 정도의 수정능력을 보유하고 있다고 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권1호
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• pp.33-39
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• 2002

소 체세포 핵이식 시 융합액 내 $Ca^{2+}$ 농도에 따른 융합율, 핵형의 변화, 배 발달율을 검토한 결과는 다음과 같다. 1. 융합액 내 $Ca^{2+}$ 농도를 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mM로 각기 다르게 처리한 결과, 0.5와 1.0 mM의 CaC$_2$에서 융합율이 80.5 와 84.3%로 나타나 0.05 mM CaCL$_2$에서의 융합율 56.6%에 비하여 유의적(P＜0.01)으로 높았다. 2. 융합액 내 $Ca^{2+}$ 농도에 따른 재구축배의 핵형을 검토한 결과, CaCL$_2$농도 0.05와 0.1 mM 에서는 88.4와 84.0%의 난자가 PCC이후 염색질괴를 형성한 반면, 0.5와 1.0 mM 에서는 54.5와 59.3%가 PCC 형태를 거치지 않고 직접 전핵을 형성하여, $Ca^{2+}$ 농도가 증가함에 따라 PCC 형태를 거치지 않고 직접 전핵을 형성하는 난자의 비율이 증가하였다. 3. 핵이식란의 체외 발육율을 검토한 결과, 1.0 mM CaCl$_2$에서는 배반포 발육율이 30.6%로 나타난 반면, 0.1 mM CaCl$_2$에서 는 20.0%로 나타나 유의적(P＜0.05)인 차이를 나타냈다. 본 연구의 결과는 융합액 내 $Ca^{2+}$농도의 증가가 소 체세포 핵이식란의 융합율 및 배반포 발육율을 향상시킬 수 있음을 시사한다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권1호
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• pp.1-5
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• 2006

핵이식 방법을 이용하여 성공적인 복제를 이루기 위해서 인위적인 활성화 처리는 필수적인 요소이다. 본 연구는 전기자극에 의해 활성화된 난자를 chemical agent를 이용하여 추가적인 활성화 처리를 하였을 때 돼지 단위발생란의 발달에 미치는 영향을 알아보고자 수행되었다. 체외에서 $40{\sim}44$시간 동안 배양된 난자를 전기자극(E)으로 활성화 처리한 후 Thimerasol + Dithiothreitol(Thi+DTT), 6-Dimethylaminopurine(6-DMAP) 및 Cycloheximide(CH)를 사용하여 추가 활성화 처리를 하였다. 활성화 방법(E, E+Thi+DTT, E+6-DMAP 및 E+CH)에 따른 단위발생란의 배반포까지의 발달율을 조사한 결과, chemical agent에 의해 추가 활성화된 단위발생란이 전기자극만으로 처리된 구의 단위발생란보다 유의적으로 높은 발달율을 보였다($21.5{\sim}28.1%$ vs. 18.0%, P<0.05). 특히, E+Thi+DTT를 이용하였을 때 발달율이 유의적으로 높게 나타났다(28.1%, P<0.05). 활성화 처리별 전핵 형성율을 조사한 결과, chemical agent에 의해 추가 활성화 처리된 구에서 하나의 극체(1PN) 형성률은 처리별로 차이를 보이지 않았으나$(59.9{\sim}64.7%)$, 2PN 형성율은 추가 활성화 처리구에서 전기자극만을 사용하였을 때보다 유의적으로 높게 나타났다($7.2{\sim}9.7%$ vs. 4.3%, P<0.05). 이상의 결과를 살펴볼 때, 전기자극 후 chemical agent를 이용한 추가 활성화는 단위발생란의 배반포까지의 발달능력을 증가시키는 것으로 생각된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제16권3호
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• pp.223-231
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• 2001

The success of nuclear transplantation with mammalian oocytes depends critically on the potential of oocytes activation, which mainly caused to prevent the re-accumulation of maturation promoting factor (MPF). This study was conducted to compare the effect of combined treatment of lonomycin with a Hl-histone kinase inhibitor (dimethylaminopurine, DMAP) or cdc2 kinase inhibitor (sodium pyrophosphate, SPP) on activation of bovine oocytes. In vitro matured bovine oocytes with the first polar body (PB) and dense cytoplasm were assigned to 3 experimental groups. For activation treatment, oocytcs were exposed to 5 $\mu$M lonomycin for 5 min (Group 1), and followed by 1.9 mM dimethylaminopurine (DMAP) for 3 h (Group 2) or followed by 2 mM sodium pyrophosphate (SPP) for 3 h (Group 3). The activation effects in the three treatments and the control group (untreated) were judged by the extrusion of the second PB and formation of a pronucleus (PN). Differences among groups were analysed using one-way ANOVA after arc-sine transformation of proportional data. All three treatments led to high activation rates (90% to 95%), with significant difference from the control. However, the extrusion of the second PB and the rate of PN formation differed remarkably among treatments. In Group I and 3, about 95% of the oocytes had extruded the second polar body, but one PN had formed in a higher proportion of oocytes in Group 3 than in Group 1 (90% vs. 5%). In experiment 2, the rates of cleavage and development into blastocysts in Group 1 were significantly lower than those of Group 2 and 3 (8.7% and 0% vs. 50.5% and 11.6%, and 44.6% and 7.2%, respectively, P<0.05). In experiment 3, ~80% of parthenotes in Group 1 were developed with haploid chromosomal sets. However, when ionomycin was followed immediately by DMAP (Group 2). only 20% of parthenotes were haploid. In Group 3, combined treatment with ionomycin and SPP, the appearance of abnormal chromosomal tracts was significantly (P〈0.05) reduced and the proportion of haploid parthenotes was increased to 85% (17/20) than in Group 2. These results demonstrate that SPP acted as a cdc2 kinase inhibitor and formed the haploidy in oocyte activation. Thus, the present study suggests that cdc2 kinase inhibitor, such as sodium pyrophosphate, may have an effective role in oocyte activation for the production of cloned embryos/animals by nuclear transplantation.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제36권3호
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• pp.147-154
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• 2012

본 연구에서는 제주흑우의 유전자원 보존과 증식에 있어 성공적인 인공수정을 위한 안정적인 동결정액 제조법을 수립하고 동결 융해 후 정자의 품질을 개선하기 위하여 제주흑우의 동결 정액 제조시 LDL, taurine, hypotaurine 그리고 trehalose를 첨가하여 이들이 동결 융해 후 정자의 성상에 미치는 영향에 대하여 알아보고자 수행하였다. 제주흑우의 정액 동결 시 LDL, LDL-taurine, LDL-hypotaurine 그리고 LDL-trehalose의 첨가는 ($63.40%{\pm}7.39$, $69.70%{\pm}6.12$, $67.25%{\pm}3.21$, $64.55%{\pm}2.43$) 대조구에($56.25%{\pm}6.42$) 비하여 모두 유의적인 생존율의 증가를 나타냈다 (p<0.05). 정자막 온전성 검사를 통한 꼬리막 팽창 정자의 비율은 LDL-taurine을 첨가 실험구에서 $70.55%{\pm}5.16$, LDL-hypotaurine 첨가 실험구에서 $64.45%{\pm}5.85$, LDL-trehalose 실험구에서 $64.50%{\pm}2.78$, LDL 단독 첨가 실험구에서 $61.65%{\pm}5.18$로 대조구 $51.90%{\pm}9.99$보다 모두 유의적으로 높은 결과를 나타냈다 (p<0.05). 동결 융해 후 정자의 첨체막 변화 양상에 있어서는 B pattern의 비율은 대조구와 실험구 모두 유의적 차이가 없었으며, F pattern은 LDL-taurine의 조합만이 대조구와 유의적인 차이를 나타내며 증가하였다 (p<0.05). 그러나 AR pattern의 비율은 LDL-taurine, LDL-trehalose, LDL-hypotaurine 그리고 LDL 처리의 순으로 대조구에 비하여 모두 유의적으로 낮은 수준의 AR pattern의 비율을 나타냈다(p<0.05). 정자의 수정능력 평가에 있어 LDL-taurine, LDL-hypotaurine 그리고 LDL-trehalose 모두 대조구에 대하여 유의적으로 높은 웅성전핵 형성율과 SFI를 나타냈으며 (p<0.05), 특히 LDL-taurine의 첨가는 LDL의 단독 처리에 비하여도 유의적으로 높은 수준의 웅성전핵 형성율과 SFI를 나타냈다 (p<0.05). 또한, decondenced sperm 비율에 있어 LDL, LDL-taurine, LDL-hypotaurine 그리고 LDL-trehalose 실험구 모두 대조구에 비하여 유의적으로 높은 결과를 나타냈다 (p<0.05). 본 연구의 결과는 제주흑우 정액의 동결정액 제조에 있어 안정적인 제조법을 공급할 수 있으며, 동결 융해 후 정자의 기능 개선 방법에 보다 많은 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제27권2호
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• pp.125-133
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• 2003

본 연구는 돼지 난포란의 체외배양액에 황화합물인 $\beta$-mercaptoethanol($\beta$-ME)을 첨가배양함으로서 돼지난포란의 체외성숙과 체외배발달에 미치는 향을 구명하고자 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 돼지난포란을 체외성숙배양액인 NCSU-23 배양액에 $\beta$-ME를 각각 0, 25, 50 및 100$\mu$M 첨가배양하여 성숙을 유기한 다음, 체외수정을 실시한 결과, 모든 처리구에서 핵성숙률, 정자침투율, 웅성전핵형성률, 다정자침입률 및 평균침입정 수에서 유의적인 차이가 인정되지 않았다 P>0.05). 2. 체외성숙 및 수정을 실시한 후, 배발달 배양액인 NCSU-23에 7일간 배양한 결과, 배반포 형성률은 25$\mu$M의 $\beta$-ME 처리구가 유의적(P<0.05)으로 높은 결과를 나타냈고, 총세포수에 있어서는 대조구와 처리구간 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 3. 배발달배양액인 NCSU-23에 $\beta$-ME를 각각 0, 12.5, 25 및 5$\mu$M 첨가하고 5 및 20%산소조건 하에서 7일간 배양한 결과, 처리구별 산소농도에 따른 배발달률 및 총세포수에 있어서는 유의 적 인 차이가 없었으나, 25$\mu$M $\beta$-ME 처리구에서 유의적으로 높은 결과를 나타냈다(P<0.05). 그러나 총세포수에서는 처리구 및 대조구간 유의성이 인정되지 않았다. 결론적으로 돼지난포란의 체외성숙 및 배발달시 황화합물인 $\beta$-ME의 첨가는 25$\mu$M이 가장 적합하며, 산소농도에 따라서는 영향을 미치지 않는 것으로 조사되었다.

• 대한수의학회지
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• 제32권3호
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• pp.435-450
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• 1992

To evaluate the fertilizing capacity of domestic animal spermatozoa by hamster test, semen were collected from 15 boars(Duroc, Landrace, and Yorkshire) and 2 mixed dogs which had been proved to be fertile in the past then, the semen were preserved in BWW medium at $4^{\circ}C$ or $18^{\circ}C$ for about 20 hours and coincubated with zona-free hamster ova for 5 hours. The ova were stained by lacmoid and examined under phase contrast microscope to investigate the rates of sperm binding to the ova, penetration and formation of a male pronucleus, and the numbers of both bound and penetrated sperm per ovum. Both the semen preserved at $18^{\circ}C$ for about 20 hours and that treated by swim up procedure showed considerably higher rates of sperm binding and penetration as well as higher number of penetrated sperm than that preserved at $4^{\circ}C$ for about 20 hours, respectively(p<0.01). Motility of boar sperm at insemination was from 40 to 90% and no difference in hamster test was obtained according to different degree of sperm motility. Abnormality in morphology of boar sperm at insemination was from 6 to 45% and no difference in hamster test was obtained according to different degree of sperm abnormality. The sperm concentrations of $7{\times}10^7$ and $7{\times}10^6$ showed considerably higher rates of sperm binding and penetration as well as higher number of bound sperm than that of $7{\times}10^4$ (p<0.01) along with the same higher results than that of $7{\times}10^5$(0<0.05), respectively. Boar sperm showed considerably higher rates of sperm binding and penetration as well as higher numbers of both bound and penetrated sperm than dog sperm, when both semen were treated by BWW＋heparin medium and swim up procedure, respectively. These results indicated that fertile boar sperm showed considerably lower rates in the results of hamster test, when preserved at $4^{\circ}C$ for about 20 hours and in lower concentration of sperm than when preserved at $18^{\circ}C$ for about 20 hours and in higher concentration of sperm, respectively, and at the same time considerably higher results than fertile dog sperm, consequently to prove that hamster test would be of great value in assaying the fertilizing capacity of boar sperm.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권1호
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• pp.59-67
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• 2000

본 연구는 핵이 제거된 소난자 내에 소의 태아 섬유아세포를 이식한 후 난자의 발달능력을 조사하였다. 소 태아 섬유아세포는 45일된 응성 태아로부터 분리한후 MitoTracker로 염색하고 세포 주기를 동기화시키지 않은 세포를 핵이 제거된 소난자의 위란강 내에 이식하였다. 섬유아세포와 소난자의 복합체는 전기 자극을 주어 융합시키는 방법을 이용하였으며, 융합된 난자는 Calcium ionophore와 6-DMAP를 이용하여 난활성을 유도시킨 다음 CR1aa 에서 배양하였다. 핵치환 된 난자의 핵은 핵질 응축과정, 팽대과정, 전핵 형성과정이 일어났으며, 이러한 과정에서 재구성된 난자는 분열 과정을 거쳐 18∼26시간 사이에는 2-세포기로 발달하였다. 섬유아세포의 미토콘드리아는 핵치환시 난자 내로 이전되었는데 이것들은 난자 내에서 빠르게 사라지는 것으로 관찰되었으며, 핵융합 후 8시간째에는 섬유아세포의 미토콘드리아가 전혀 관찰되지 않았다. 2-세포기로 분열된 난자의 21% 가 이식 가능한 단계인 배반포 단계까지 발달하였다. 이러한 결과는 소의 태아 섬유아세포가 탈핵된 소난자 내에서 성공적으로 재분화과정을 거치며, 이렇게 재조합 된 수정란은 배반포 단계까지 발달이 가능하다는 것을 보여주고 있다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제24권3호
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• pp.301-309
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• 1997

본 연구에서는 체외수정, 난자내 정자 직접주입, 난자내 정자 두부 미두 주입 후의 핵과 미세소관의 변화를 관찰하였다. 핵과 미세소관의 움직임은 형광염색을 실시한 후 공초점주사현미경을 이용하여 관찰하였다. 체외수정에서 관찰된 바와 동일하게 정자를 난자에 직접주입 한 직후 정자 중편부에서 성상체가 형성되었고, 이 성상체에 의해 자성 웅성 전핵이 융합되는 것으로 관찰되었다. 그러나 난자내 정자를 직접주입하였을 경우 웅성전핵으로 발달하는 비율이 낮았다. 이는 주입된 정자가 원형질막과 perinuclear theca에 싸인 체 난자내로 들어가 난자내의 sperm nucleus decondensing factor와 정자 핵과의 반응이 억제되기 때문으로 생각된다. 정자 두부 만을 주입하였을 경우 성상체가 형성되지 않았지만 자성 웅성 전핵 사이 또는 그 주위에서 두터운 미세소관층이 관찰이 되었다. 따라서 소에 있어서는 정자의 중편부에 위치하여 microtubule organizing center (MTOC)의 역할을 하는 중심립 또는 중심체 없이도 모계에서 유래된 미세소관이 형성되어 이것이 전핵의 융합과 세포분열에 관여하는 것으로 생각된다. 정자의 미부 만을 주입하였을 경우 성상체가 형성이 되지 않았으며, 자성핵 사이에 형성된 미세소관과 떨어져서 관찰되었다. 따라서 주입된 정자의 꼬리는 미세소관형성과 관련이 없는 것으로 생각된다. 이러한 결과는 소에 있어서, 수정 시 정자로부터 유래되는 중심립 또는 중심체가 없이도 미세소관을 형성하여 미세소관에 의해 이후의 배발달이 정상적으로 일어남을 보여주고 있다.