• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권2호
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• pp.113-117
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• 2004

본 연구는 돼지 난포란을 이용하여 생산된 1-세포기의 체외수정란을 NCSU-23, PZM-3 및 PZM-4의 세 가지 배양액과 서로 다른 산소농도를 부여하여 돼지 체외수정란의 적합한 체외배양조건을 구명하고자 실시하였다. 돼지 난포란의 체외성숙은 BSA가 미첨가 된 NCSU-23 배앙액에 10% pFF, 0.9 mM crysteine, 25 $\mu/ml \beta$-mercaptoethanol 및 10 ng/$\mu/ml$ epidermal growth factor와 호르몬(10 IU/$ml$ PMSG, hCG)을 첨가하여 20∼22시간과 추가로 호르몬을 제거한 배양액에 20∼22시간을 배양하여 성숙을 유기하였고, 5∼6시간 동안 돼지 액상정액과 공배양함으로써 체외수정을 유기하였다. 체외수정 5∼6시간후 각각 5% 및 20%의 산소조건하의 NCSU-23, PZM-3 및 PZM4 배양액에서 배발달을 유기하였다. 돼지체외수정란을 체외배양하였을 때, 배발달 48시간에 처리구간 난할율에는 차이가 없었으나, 배양 7일째 배반포형성률은 5% 산소조건의 PZM-3 배양액에서 가장 높게 나타났다(19.9 $\pm$ 2.4 vs. 11.1$\pm$2.0 to 16.0$\pm$2.5%, P<0.05). 그리고, 총세포수에 있어서 5%의 산소조건 하에서 배양하는 것이 20% 산소조건보다 유의적(P<0.05)으로 높았으나, 배양액간 차이는 인정되지 않았다. 따라서, 체외생산된 돼지초기수정란의 체외배발달은 5% 산소조건하의 PZM-3 배양액에서 배양하는 것이 좋은 것으로 나타났다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권2호
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• pp.125-133
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• 2006

This study was conducted to detect the apoptosis incidence in blastocysts and to compare the abundance of Bax, Bcl2L1, VEGF and FGFR2 in in vitro fertilized (IVF), parthenogenetic (PAT) and nuclear transfer (NT) embryos. Oocytes matured for 40 hr were enucleated and reconstructed with confluenced fetal fibroblasts (FFs) derived from a ${\sim}45$ day fetus. Reconstructed eggs were then fused with 2 DC pulses (2.0 kV/cm, $30{\mu}sec$) and cultured with $7.5{\mu}g/ml$ cytochalasin B for 3 hr. Parthenotes (PAT) were produced with the same electric strength and culture for NT eggs. The embryos were cultured in NCSU-23 medium at $39^{\circ}C,\;5%\;CO_2,\;5%\l;O_2$ in air. In 3 runs, set of 10 embryos at the 4-cell to blastocyst stages were used to extract total RNA for analyzing the gene expression patterns of pro-apoptotic (Bax), anti-apoptotic (Bcl2L1), vasculogenesis (VEGF), implantation (FGFR2III) using real-time quantitative PCR. Cleavage and blastocyst rates were significantly higher (P<0.05) in IVF and PAT ($79.3{\pm}8.5\;and\;25.5{\pm}6.1,\;and\;85.0{\pm}6.4\;and\;38.6{\pm}5.5$, respectively)than NT counterparts ($65.1{\pm}5.2\;and\;15.6{\pm}3.0$, respectively). Significantly higher (P<0.05) total cells were observed in IVF controls and PAT ($34.7{\pm}5.8\;and\;38.1{\pm}4.1$) than NT embryos ($24.8{\pm}3.2$). Apoptosis index was significantly lower (P<0.05) in IVF than NT embryos. The Relative abundances (RA) of Bax and VEGF were significantly higher (P<0.05) at blastocyst stage in NT than IVF control. The RA of Bcl2L1 and FGFR2III were significantly higher (P<0.05) at blastocyst stage in IVF than NT. The present study observed the abnormal gene expressions in NT embryos at various developmental stages, suggesting certain clues to find out the cause of the low efficiency of NT to term.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제20권12호
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• pp.1820-1826
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• 2007

In this study, we conducted various experiments in order to develop enhanced cultural conditions for in vitro-produced porcine embryos. All embryos were produced by in vitro maturation (IVM) and fertilization (IVF) of immature oocytes from abattoir-derived ovaries. In experiment 1, we cultured IVF embryos in 4 different groups, namely, 0% bovine serum albumin (BSA), 3% BSA, 0.05% Polyvinyl alcohol (PVA), and 0.5% Polyvinylpyrrolidone (PVP) added to the basal fluid cultural medium, Porcine zygote medium 3 (PZM-3). The rates of embryo development were higher in the group where the PZM-3 media had been supplemented with 3% BSA than the other groups. While not statistically significant, the percent of blastocysts and hatched blastocytes were 6.9% and 25.0% in the 3% BSA group vs. 1.2-6.4% and 0-16.7% in the other groups, respectively. In experiment 2, we added 10% fetal bovine serum (FBS) to PZM-3 on day 0 of culture and observed the development rate of blastocysts per day of culture from days 0 to 5. The development rate of blastocysts was higher at 15.6% on day 4 than on any other day, and was significantly higher than on day 0 or day 1 (p<0.05). The development rate of hatched blastocysts was 26.7% on day 4, and was higher than on any other day. In experiment 3, we cultured IVF embryos with different fluid culture media, grouped as 1) PZM-3+0.3% BSA (day0-day7); 2) PZM-3+0.3% BSA${\rightarrow}$day-4) PZM-3+10% FBS; 3) PZM-3+0.3% BSA${\rightarrow}$PZM-3+0.3% BSA+(day-4) FBS 10%; and 4) PZM-3+0.3% BSA+10% FBS (day0-day7). The development rates of blastocysts and hatched blastocysts were 21.5% and 53.1% in group 3, respectively, which was significantly higher than group 4 with respect to blastocyst development (5.2%, p<0.05) but not hatched blastocysts (14.3%). The total cell number (TCN) of blastocysts in group 3 was higher at $37.8{\pm}16.1$ than the other groups at $16.8{\pm}4.4$ - $30.1{\pm}10.9$; however, this was not significantly different. The results of this study showed that PZM-3 containing 0.3% BSA and supplemented with FBS during the later stage of culture on day 4 resulted in better TCNs and an increased rate of hatched blastocysts.

• 한국수정란이식학회지
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• 제9권1호
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• pp.85-93
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• 1994

This study was carried out to investigate the effects of gonadotropins added during maturation of porcine oocytes on the in vitro maturation(IVM), in vitro fertilization(IVF) and developmental potential of embryos. The follicular oocytes were cultured in TCM-199 medium containing different combination of gonadotropins(5$\mu$g /ml FSR or 1OIU /ml PMSG and 1O$\mu$g /ml LH or 1OIU /ml hCG), 10% FCS and 10% PFF for 36~48h in a incubator with 5% $CO_2$ in Air at 39$^{\circ}C$ and then matured oocytes were again cultured to 120h after IVF for 6~7h with heparin(100$\mu$g /m')-treated sperm. When the oocytes were matured for 42brs in the medium containing FSH+LH, FSH+hCG, PMSG+LH or PMSG+hCG, the JVF rate of each treatment was 50.0%, 52.9%, 66.7% and 70.0%, respectively. The highest CEI (cumulus cell expansion index) was obtained from PMSG+hCG-added medium and the highest polyspermic penetration resulted from FSH+LH-added medium. The cleavage of IVF oocytes derived from hormone added IVM was significantly(P<0.05) promoted by PMSG+hCG and the cleavage rate after 36-h, 42-h and 48-h maturation aws 53.0%, 56.7% and 45.6%, respectively. The highest developmental potential resulted from the oocytes derived from PMSG+LH -added IVM.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권1호
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• pp.63-69
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• 2001

본 연구는 돼지 미성숙 난포란을 체외에서 성숙, 수정시킨 후, 체외배양액내에 NO Scavenger인 hemoglobin과 억제제인 L-NAME의 첨가 배양이 돼지 체외수정란의 체외발육에 미치는 효과를 검토하였다. 체외배양 44시간에 NCSU 배양액에 hemoglobin을 각각 0, 1 및 5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$가 첨가된 처리구에서 상실배기 이상 발육된 수정란의 체외 발육율은 각각 52.4%, 57.6% 및 57.4%로써 hemoglobin 첨가군이 대조군에 비해 다소 높은 발육성적을 나타냈으나 통계적 유의성은 인정되지 않았다 (P〉0.05). 체외배양 96시간에 NCSU23 배양액에 hemoglobin을 0, 1 및 5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 첨가한 처리구에서 상실배이상 발육된 체외 발육성적은 각각 66.2%, 70.8% 및 62.8%로 1$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ hemoglobin을 첨가한 처리구가 다른 처리구보다 다소 높게 나타났지만 통계적으로 유의차는 인정되지 않았다 (P〉0.05). 체외배양 44시간에 NCSU23 배양액에 L-NAME를 각각 0, 10, 50 및 100mM을 첨가한 처리구에서 상실배기 이상 발육된 체외발육율은 각각 65.2%, 73.5%, 70.1% 및 58.8%로 L-NAME를 10mM첨가한 처리구와 50mM 첨가한 구가 무 첨가구와 100mM 첨가구보다 통계적으로 유의하게 높은 성적을 얻었다 (P＜0.05). 각 처리구에서 생산된 배반포기수정란의 세포수에는 커다란 차이가 인정되지 않았다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.68-68
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• 2001

Blastocyst formation, consisting of the inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE), is the first differentiation process during embryonic development in mammals. It has been hypothesized that the proportion of ICM to TE in the blastocyst may be crucial for subsequent developmental competence of early embryos, which it may be expressed as a sensitive indicator for evaluating in vitro systems. In this study ICM/total cell ratio of nuclear transfer (NT) embryos was compared with IVF-derived and in vivo embryos. Somatic cell nuclei obtained from a fetus at Day 40 of gestation were transferred into the enucleated oocyte and then cultured in NCSU 23 medium for 6 days as previously described (Koo et al., Biol. Reprod. 2000; 63:986-992). ICM and TE cells of blastocysts were determined by using a differential staining method (Han et al., Biol. Reprod. 1999; 60:1110-1113). Development rate (9.8$\pm$2.5%, 23/225) to the blastocyst stage of NT embryos was lower than IVF embryos (23.8$\pm$2.7%, 53/223). Thus, a difference was detected in the in vitro developmental rate to blastocyst stage between NT and IVF-derived embryos (P<0.05). In the next experiment, we investigated ICM and TE nuclei to assess the quality of blastocysts that produced by NT, IVF and in vivo, respectively. NT blastocysts (27.6$\pm$8.3) showed a smaller total cell number than IVF-derived (42.6$\pm$17.4) and in vivo embryos (283.9$\pm$103.5) (P<0.05). Ratios of ICM/total cells in NT, IVF and in vivo blastocysts were 15.1$\pm$ 18.6% (n=56), 12.3$\pm$9.2% (n=57) and 30.4$\pm$6.8% (n=40), respectively. Individual blastocysts for the ratio of ICM/total cells were assigned to 3 groups (I; <20%, II; 20 to 40% and III;>40%). As the results, most in vivo blastocysts (97.5%, 39/40) were distributed into group II while most NT (78.6%, 44/56) and IVF-derived blastocysts (82.5%, 47/57) were allocated to group I. Thus, our data show that NT or IVF-derived embryos have aberrant morphology during early development in vitro systems, suggesting that these anomalies may result in developmental failures of the NT embryos to term.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2004년도 춘계학술발표대회
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• pp.170-170
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• 2004

First of all, in vitro production (IVP) of porcine embryos is an important as initial step to improve bio-technical applications such as transgenesis and cloning for xenotransplantation. In recent years, considerable progress has been achieved in the IVP embryos using advanced methods for in vitro maturation (IVM) and fertilization (IVF). (omitted)

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.275-282
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• 2004

본 연구는 체외성숙/체외수정 유래의 돼지 난자를 이용하여 체외발달시 배양액의 종류나 교체에 따른 영향을 구명하고자 수행하였다. mNCSU-23에서 체외성숙시킨 다음 mTBM에서 체외수정시킨 난자를 목적에 따라 두 가지로 나누어 실험한 결과는 다음과 같다. 1. 체외성숙/체외수정란을 NCSU-23에서 배양액 교체없이 7일 동안 배양하거나 CZB에서 4일 배양한 다음 Pig-MEM으로 옮겨서 나머지 3일간 배양한 결과, 난분할율은 배양액간 차이를 보이지 않은 반면, 추정수정란대 배반포 발달을(P<0.05)과 분할란대 배반포 발달율은 NCSU-23에서 배양된 것이 유의적으로 높았다(P<0.01). 그러나 배 반포의 ICM 세포수, TE 세포수 및 총세포수에서는 모두 차이가 없었다. 2. 체외성숙/체외수정란를 NCSU-23에서 배양액 교체없이 7일 동안 배양하거나 체외배양 5일째에 신선한 동일 배양액이나 0.4％ BSA를 10％ FBS로 대체한 배양액(mNCSU-23F)으로 완전히 교체하여 배양한 결과, 난분할율, 배반포발달율, 배반포의 ICM 세포수, TE 세포수 및 총세포수 모두 처리간 유의적인 차이를 보이지 않았다. 결과적으로, NCSU-23이 CZB/Pig-MEM보다 체외성숙/체외수정 유래의 난자를 체외발달시키는데 적합한 것으로 사료되며, 체외발달배양 과정에 신선한 배양액이나 일부 변경된 배양액으로의 교체에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.245-255
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• 2004

포유동물 난자의 체외수정은 외래유전자 도입에 의한 형질전환동물 생산과 우수한 형질을 가진 개체의 보존, 인간의 불임연구 등과 같은 수정란이식 기술로서 널리 이용되고 있다. 돼지 난포란을 이용한 체외수정란의 생산은 초기단계인 체외성숙 기술의 미확립, 그로인한 체외수정 시 높은 다정자 침입율과 불완전한 웅성전핵 형성 몇 체외발달능 정지현상(cell blocking) 등 어려움 때문에 아직도 다른 가축보다 양질의 수정란을 생산하기가 어려운 것으로 알려져 있다. 이와 같은 것을 해결하기 위하여 많은 연구자들은 배양액내에 hormon, growth factor, antioxdants 등과 같은 외인성 인자들을 첨가하고 있다. 이들 인자 중 antioxdant는 free radical을 소거하고 과산화물 생성을 억제하여 난자를 산화적 스트레스로부터 보호한다. 따라서 본 연구는 돼지 난포란으로부터 체외수정란의 생산에 있어서 배양액내 cysteine, catalase 및 glutathione의 첨가가 체외성숙, 체외수정 및 체외배양에 어떤 영향을 미치는지를 검토하였다. 실험 1은 체외성숙용 배양액인 TCM-199 용액에 catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)의 첨가, 실험 2는 성숙된 난자의 체외수정용 배양액인 mTBM 용액에 cysteine(0.1, 1.6, 1.0mM/$m\ell$), catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)의 첨가, 실험 3은 체외성숙 및 체외수정된 난자의 체외배양용 배양액인 NCSU-23 용액에 cysteine(0.1, 1.6, 1.0mM/$m\ell$), catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)을 첨가하여 배반포로의 배 발달율을 관찰하였던 결과는 다음과 같다. 1. 체외성숙시 catalase의 경우는 500U 첨가군의 27.2%로 무첨가군의 15.4%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 한편 glutathione의 경우 배반 포로의 배 발달율은 무첨가군과의 차이는 없었다. 그러나 1.0mM 첨가군에서 상실배까지의 배 발달율인 72%는 무첨가군의 53.9%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 2. 체외수정시 여러 종류의 항산화제 첨가는 첨가하는 농도와 관계없이 배반포로의 배 발달율은 무첨가군과 차이가 없었다. 3. 체외배양시 여러 종류의 항산화제 첨가는 첨가하는 농도와 관계없이 배반포로의 배 발달율은 무첨가군과 차이가 없었다. 이상의 결과를 종합적으로 하면 돼지 난포란을 이용한 배반포의 체외생산에 있어서 배양액내 항산화제의 첨가는 체외성숙단계에서만 효과적이었다. 이것은 아마도 항산화제가 체외성숙 시 난포란 내에서 일어나는 여러 가지 생화학 반응의 처리시간과 관련하여 활성화시킴으로써 난포란의 생존력을 높인 것이라고 사료되기 때문에 앞으로는 돼지 난포란의 효율적인 체외성숙에 대해서 배양액내 첨가물질은 물론 나아가서 방법론적인 측면에서 더욱 연구되어져야 할 것이다.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한불임학회 2003년도 제45차 추계학술대회
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• pp.101-102
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• 2003