• Applied Biological Chemistry
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• 제46권1호
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• pp.7-11
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• 2003

감자 polyphenol oxidase의 구리결합지역 DNA와 histidine 다량 함유 인공 펩타이드를 암호화하는 DNA를 대장균 벡터에 각각 클로닝하여 발현시킨 후 대장균 내의 구리함량 증감을 조사하였다. Polyphenol oxidase의 구리결합지역 DNA를 포함하는 PPOCBpET32 벡터를 함유하는 균주의 경우는 벡터를 함유하지 않는 대장균 대조구보다 오히려 구리 함량이 약간 감소하여 약 600ppm의 간을 보여주어, 감자 polyphenol oxidase 구리결합지역의 대장균 내에서의 발현이 구리 함량 증가에 기여하지 못함을 알 수 있었다. 반면에 한 개의 hexahistidine 단위 DNA를 포함하는 pET28a 벡터 함유 대장균 균주를 knamycin 미첨가 배지에서 배양한 경우에는 구리 함량이 약 2,500ppm으로 높게 나타났다. 한편 hexahistidine 9개로 구성된 polyhistidine을 암호화하는 DNA를 포함하는 pET-his 벡터 함유 균주를 kanamycin 미첨가 배지에서 배양한 경우에 구리함량이 약 3,200ppm으로 나타나, 하나의 hexahistidine 단위만 발현하는 균주와 비교하여 구리함량이 약 30% 증가됨을 알 수 있었다.

• 약학회지
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• 제46권4호
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• pp.270-275
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• 2002

The lectin gene from rice was amplified by the polymerase chain reaction. The amplified DNA was inserted into the expression vector pET26b and expressed it as a fusion protein with polyhistidine sequences in Escherichia coli. The recombinant protein was produced by induction with 0.4 mM isopropyl-$\beta$-D-thiogalactopyranoside at 37$^{\circ}C$ and purified by an immobilized metal affinity chromatography. The recombinant protein was found to have lectin activity by the hemagglutination inhibition assay. The hemagglutination activity of the recombinant protein was optimal at pH 4.0-7.0 and was dependent on $Ca^{2+}$ and Mn$^{2+}$.2+/.

• 생명과학회지
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• 제28권12호
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• pp.1416-1423
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• 2018

Biotin에 강한 결합 친화력($K_D=10^{-14}M$)과 함께 streptavidin의 tetramer 특징은 VHH 항체를 streptavidin에 융합시키게 하여 biotinylated horseradish peroxidase를 사용하는ELISA 와Western blot analysis 등의 면역분석법에서 VHH 항체의 항원결합력을 증가시키는데 응용 가능하다. 이를 응용하기 위해 우리는 Streptomyces avidinii 염색체 DNA로부터 PCR을 통해 streptavidin유전자를 증폭하고 이를 green fluorescent protein항원에 특이적으로 결합하는 8B9 VHH 항체유전자에 융합시켰다. 대장균에서 수용성 융합단백질로 발현시키기 위해 pUC119 플라스미드에 기초한 발현시스템을 사용하였다. 즉 lacZ promoter를 사용하여 IPTG에 의해 단백질발현을 유도하게 하였으며, 아미노말단에 pelB leader를 두어 발현된 단백질의 periplasmic space로 이동하게 하여 수용성 단백질형태의 분비를 촉진하였으며 카르복시말단에 6개의 polyhistidine tags를 두어 $Ni^+$-NTA-agarose column을 사용하여 발현된 단백질을 정제하였다. Streptavidin이 biotin에 강하게 결합함으로 대장균에 독성을 나타냄에도 불구하고 본 수용성 융합단백질은 성공적으로 발현되었다. SDS-PAGE에서 가열하는 경우 변성되어 30.6 kDa를, 가열하지 않는 경우에는 자연 상태의 122.4 kDa을 나타내었다. 이는 8B9 VHH항체에 융합된 streptavidin moiety에 의해 monomer subunit가 비공유결합으로 tetramerization됨을 제시해준다. 또한 본 융합단백질은 ELISA와 Westernblot analysis에서 보여진 것처럼 parental streptavidin과 유사한 biotin결합력과 green fluorescent protein항원 결합력을 모두 나타내었다. 결론적으로 streptavidin에 융합된 8B9 VHH 항체형태의 융합단백질은 대장균에서 수용성 tetramer로 성공적으로 발현 및 정제되었으며 biotin과 green fluorescent protein 항원에 동시에 결합함으로써 tetrameric and bifunctional VHH 항체제조의 가능성을 제시해주었다.