• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제14권2호
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• pp.65-74
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• 2010

지금까지 태반에서 monoamine들을 재 흡수할 수 있는 몇 가지 membrane transporter들이 발현됨이 보고되었다. 그러나 카테콜라민 트렌스포터(norepinephrine transporter, NET)의 발현과 부인과 질환을 포함한 태반 발달과의 연관성에 관한 연구는 거의 보고된 것이 없다. 본 연구의 목적은 태반에서 NET의 발현을 동정하고, 그 기능을 알아보고자 하였다. 이를 위해 정상과 자간전증(preeclampsia) 태반에서 각각 NET 단백질을 동정하고, 영양막세포주인 HTR8-SV/neo 영양막 세포에 NET 유전자를 주입 후 그 기능을 분석하였다. NET 발현을 분석하고자 태반조직에서 다음과 같이 환자를 분류하여 semi-quantitative RT-PCR과 면역조직화학 방법을 사용하였다. 분만 고통이 없는 산모의 태반을 중심으로(none underwent labor): 1) 만기 정상 태반(term normal placenta)(n=15); 2) 만기 자간전증 태반(term with preeclamptic placenta)(n=15); 3) 중기 자간전증 태반(pre-term preeclamptic placenta)(n=11)을 수집하여, NET 발현을 RNA 수준에서 분석한 결과, mRNA 분석에서는 NET 유전자가 정상 태반 조직보다 자간전증 태반에서 낮게 발현되는 것을 확인하였다. 그러나 Western blot을 통한 NET 단백질의 변화는 거의 없는 것으로 확인되었다. HTR8-SV/neo 영양막세포를 이용하여, NET 유전자의 기능을 알아보고자 NET 유전자의 플라스미드(a plasmid vector for NET gene)와 siRNA(NET gene-specific siRNA)을 HTR8-SV/neo 영양막 세포에 24시간 동안 각각 핵 내 주입하고, NET 유전자 발현에 따른 침윤은 NET 유전자를 증가시킨 경우 대조군보다 2.5배(p<0.05) 촉진시키는 것으로 확인됐으며, NET 유전자를 감소시킨 경우는 침윤능력이 감소하는 경향이 관찰되었다. 또한 NET의 과도한 고발현 또는 저발현은 MMP-2와 MMP-9 발현과 활성을 저해하는 것이 관찰하였다. 따라서 자간전증에서 NET의 발현 감소는 영양막세포의 침윤능력을 억제하는 요인이 될 수 있다. 그러므로 이러한 결과들은 영양막세포의 침윤 기전뿐만 아니라 자간전증을 포함한 부인과 질환의 기초 연구에 지침을 제공할 것이다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제55권5호
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• pp.488-498
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• 2003

연구배경 : 세포에 방사선을 조사하면 세포사멸과 함께 AP-l, NF-${\kappa}B$와 같은 여러 전사인자가 활성화 되는 것으로 알려져 있다. 이중 염증과 면역반응의 중요한 전사인자인 NF-${\kappa}B$는 항아포프토시스의 기능이 있으며 NF-${\kappa}B$ 활성화를 차단함으로써 TNF-${\alpha}$나 daunorubicine 등에 의 한 항암효과를 상승시킬 수 있음이 밝혀져 있다. NF-${\kappa}B$의 항아포프토시스 기전은 NF-${\kappa}B$ 의존성 단백질인 cIAPI, 2의 전사발현 유도에 의한 것으로 cIAPl, 2는 caspase 3, 7, pro-caspase-9의 활성을 차단함으로써 아포프토시스를 억제하는 것으로 알려져 있다. 이에 저자들은 방사선 유도성 세포사멸에 비교적 내성을 보이는 A549 세포주에서 방사선에 의한 NF-${\kappa}B$ 활성화와 그에 따른 cIAP 발현유도를 조사하고 NF-${\kappa}B$ 활성화를 차단하여 방사선 유도성 세포사멸의 감작효과를 확인하기 위하여 본 연구를 시행하였다. 방 법 : 세포주는 A549 폐암세포주를 이용하였고, 방사선 조사는 Varian사의 Clinac 1800C 선형가속기를 이용하였으며 조사량은 10GY를 사용하였다. 세포독성 검사는 MTT Assay를 이용하였고, NF-${\kappa}B$ 활성화 검사는 luciferase reporter gene assay, electromobility shift assay, $I{\kappa}B-{\alpha}$ degradation에 대한 westem blot을 이용하였다. NF-${\kappa}B$활성을 차단하기 위하여 proteosome inhibitor인 MGI32와 $I{\kappa}B{\alpha}$-superrepressor plasmid를 transfection한 안정적 세포주 A549-$I{\kappa}B{\alpha}$-superrepressor를 이용하였다. cIAP의 발현은 RT-PCR을 이용하였고, cIAP2 promoter 활성은 NF-${\kappa}B$ site를 포함한 cIAP2 유전자 5' f1anking region(1.4kb)을 pGL2-Basic luciferase vector에 cloning 한 construct를 사용하여 transfection 후 luciferase assay를 시행하였다. 결 과 : A549 cell에서 10Gy 방사선 조사에 의한 세포독성은 24hr, 48hr에 각각 $10.82{\pm}.3%$, $17.7{\pm}6.4%$로 비교적 내성이 있음을 확인하였다. 방사선에 의한 NF-${\kappa}B$의 활성은 $I{\kappa}B-{\alpha}$ 분해에 대한 western blot과 EMSA로 확인하였으며 luciferase assay에서도 약 1.6 배 정도의 NF-${\kappa}B$ 활성화가 있었다. NF-${\kappa}B$활성을 차단하기 위해 사용한 MG132는 방사선 유도성 세포사멸에 영향을 주지 않았으며 A549-$I{\kappa}B{\alpha}$-superrepressor 세포주에서도 세포사멸의 감작효과는 없었다. 또한 RT-PCR 결과 방사선에 의한 cIAP1,2 mRNA 발현유도는 관찰되지 않았고 cIAP2 promoter luciferase assay에서도 cIAP2 전사활성 유도는 없었다. 결 론 : A549 폐암세포주에서 방사선에 의해 NF-${\kappa}B$의 활성화는 확인하였으나 활성화 정도가 미약하였고 NF-${\kappa}B$ 의존성 항아포프토시스 유전자인 cIAP가 방사선에 의해 발현유도 되지 않았으며, NF-${\kappa}B$ 활성을 차단함에도 세포독성에 감작효과가 없었으므로 A549 폐암세포주에서 방사선 유도성 세포사멸에 내성을 보이는 기전에는 NF-${\kappa}B$의 역할이 미미하리라고 사료된다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권4호
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• pp.299-306
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• 2008

선발마커로 두 종류의 항생제 (hpt와 nptII)와 제초제(bar) 유전자를 사용하여 아그로박테리움을 이용한 수정된 들깨 형질전환방법을 개발하였다. 들깨 배축 절편을 pMOG6-Bar 운반체 혹은 pCK-Bar 운반체를 가진 아그로박테리움 EHA 105와 각각 3일간 공동배양 하였다. 1차로 형성된 신초는 하이그로마이신(15mg/L)이나 카나마이신(125 mg/L)을 사용하여 선발하였고 재분화 된 신초들은 확실한 형질전환체를 얻기 위해서 포스피노트리신(1.2 mg/L)에서 한번 더 선발하였다. 뿌리는 호르몬이 없는 MS배지에서 재분화 신초로 부터 유도하였으며 80개의 재분화개체를 획득하였다. 들깨 지놈으로 형질전환유전자의 삽입은 서던 블럿으로 확인하였고 유전자의 발현은 노던 블럿으로 분석하였다. To 식물체로부터 유도된 T1들깨 종자들은 후대로의 안정된 유전자 전이를 확인하기 위하여 0.3% 바스타 제초제 살포로 확인하였다.

• International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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• 제18권1호
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• pp.18-27
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• 2009

B. thuringiensis strain LY-99 belonging to subsp. alesti (H3a3c), was isolated from Chinese tobacco warehouse and showed significantly high toxicity to Plutella xylostella. For the identification of the cry1-type genes from B. thuringiensis LY-99, an extended multiplex PCRrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) method was established by using two pairs of universal primers based on the conserved regions of the cry1-type genes to amplify around 2.4 kb cry1-type gene fragments. Then the DNA fragment was cloned into pGEM-T Easy vector and digested with EcoRI and EcoRV enzymes. Through this method, a known cry1-type gene was successfully identified from the reference strain, B. thuringiensis subsp. alesti. In addition, the RFLP patterns revealed that B. thuringiensis LY-99 included a novel cry1A-type gene in addition to cry1Aa, cry1Ac, cry1Be and cry1Ea genes. The novel cry1A-type gene was designated cry1Ah2 (Genbank accession No DQ269474). An inverse PCR method was used to amplify the flank regions of cry1Ah2 gene. Finally, 3143 bp HindIII fragment from B. thuringiensis LY-99 plasmid DNA including 5' region and partial ORF was amplified, and sequence analysis revealed that cry1Ah2 gene from LY-99 showed 89.31% of maximum sequence similarity with cry1Ac1 crystal protein gene. In addition, the deduced amino acid sequence of Cry1Ah2 protein shared 87.80% of maximum identity with that of Cry1Ac2. This protein therefore belongs to a new class of B. thuringiensis crystal proteins.

• IMMUNE NETWORK
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• 제3권1호
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• pp.29-37
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• 2003

Background: CC chemokine receptor (CCR) 7 and cognate CCR7 ligands, CCL21 (formerly secondary lymphoid tissue chemokine [SLC]) and CCL19 (formerly Epstein-Barr virus-induced molecule 1 ligand chemokine [ELC]), were known to establish microenvironment for the initiation of immune responses in secondary lymphoid tissue. As described previously, coadministration of DNA vaccine with CCR7 ligand-encoding plasmid DNA elicited enhanced humoral and cellular immunity via increasing the number of dendritic cells (DC) in secondary lymphoid tissue. The author hypothesized here that CCR7 ligand DNA could effectively expand memory CD4+ T cells to protect from viral infection likely via increasing DC number. Methods: To evaluate the effect of CCR7 ligand DNA on the expansion of memory CD4+ T cells, DO11.10.BALB/c transgenic (Tg)-mice, which have highly frequent ovalbumin $(OVA)_{323-339}$ peptide-specific CD4+ T cells, were used. Tg-mice were previously injected with CCR7 ligand DNA, then immunized with $OVA_{323-339}$ peptide plus complete Freund's adjuvant. Subsequently, memory CD4+ T cells in peripheral blood lymphocytes (PBL) were analyzed by FACS analysis for memory phenotype ($CD44^{high}$ and CD62 $L^{low}$) at memory stage. Memory CD4+ T cells recruited into inflammatory site induced with OVA-expressing virus were also analyzed. Finally, the protective efficacy against viral infection was evaluated. Results: CCR7 ligand DNA-treated Tg-mice showed more expanded $CD44^{high}$ memory CD4+ T cells in PBL than control vector-treated animals. The increased number of memory CD4+ T cells recruited into inflammatory site was also observed in CCR7 ligand DNA-treated Tg-mice. Such effectively expanded memory CD4+ T cell population increased the protective immunity against virulent viral infection. Conclusion: These results document that CCR7 and its cognate ligands play an important role in intracellular infection through establishing optimal memory T cell. Moreover, CCR7 ligand could be useful as modulator in DNA vaccination against viral infection as well as cancer.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제33권1호
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• pp.19-25
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• 2006

저온저항성 BN115 gene과 표지유전자로서 kanamycin에 저항성 있는 nptII gene을 가지고 있는 식물발현용 binary vector pBin19/BNl15가 도입된 A. tumefacience MP90을 국화잎과 공동배양 하였다. 또한 particle bombardment를 이용하여 목적으로 하는 유전자가 식물체에 안정적으로 도입되어 발현됨을 PCR 및 Real-Time PCR 검정으로 확인하였다. 국화잎과 공동배양에 사용된 Agrobacterium은 $5.0{\times}1.0{\mu}m$로 non-sporing, motile, rod 형이며, Callus는 pin이나 cork-borer에 의해 상처 난 잎 가장자리로부터 형성되어 식물체가 재분화 되었다. 유전자 도입조건은 Agrobacterium을$O.D._{600}{\approx}0.5$에서 20분간 공동배양 할 때, Particle bombardment는 helium 압력을 1,100 psi, target 거리를 9 cm로 유지했을 때, 가장 효율이 높았다. 5mg/L kanamycin이 들어 있는 배지에서 선발된 형질전환체는 PCR 분석으로 형질전환여부를 판별할 수 있었으며, 선발 10개체 중 9개체에서 purified pBN115와 같은 크기의 밴드가 형성되었다. Taq-Man probe를 이용한 Real-Time PCR 결과 $45{\sim}0.00045ng/{\mu}{\ell}$ 범위에서 pBN115 gene을 10배씩 serial dilution한 amplification plot는 일정한 간격으로 standard curve를 보였으며, slope는 -3.313975, R2는 0.998319이었다. Amplification plots의 형질전환체 $C_T$값은 $20.75{\sim}33.81$범위였으며, 유전자 copy수는 정량분석을 기초로 산출하였다. pBN115의 plasmid DNA를 serial dilution했을 때, standard는 $5.6{\times}10^{10}/45ng{\sim} 5.6{\times}10^5/0.00045ng\;copies/{\mu}{\ell}$이 었으며, 형질전환체는 $3.86{\times}10^8{\sim}12565.71 copies/{\mu}{\ell}$이었다. 따라서 PCR, Real-Time PCR 분석 결과 저온저항성 유전자가 국화의 genome에 안정적으로 도입되었음이 확인되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권3호
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• pp.253-261
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• 2007

본 연구에서는 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4-EPSPS 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되고 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 제초제 복합 저항성 감자 식물체를 육성하고자 실험하였다. Bar 유전자를 포함하는 pCAMBIA3300에 CaMV35S 프로모터에 의해 조절되는 CP4-EPSPS 유전자를 도입하여 식물체용 발현 운반체를 제작하고, 이를 Agrobacterium tumafaciens EHA105에 도입하였다. 태동밸리 잎 절편체를 Agrobacterium과 공동배양한 다음, phosphinothricin 0.5 mg/L이 첨가된 배지에서 선발하고 호르몬 무처리 MS발근시켜 형질전환체 (E3-6)를 얻었다. PCR, Southern 분석, 효소면역반응 분석 등을 통해 두 가지 유전자가 도입되었으며 이들이 정상적으로 발현됨이 확인되었다. E3-6 식물체는 glufosinate-ammonium의 어린 식물체 잎 도포처리, glyphosate 용액에 치상한 식물체 조직에서의 shikimate 축적 여부 조사를 통하여 조사한 결과, 두 제초제에 대해 저항성을 나타내었다. 또한 형질전환감자의 전식물체에 대해 glyphosate와 glufosinate-ammonium 각각의 용액 또는 이들의 혼합물을 처리한 후 제초활성 반응을 조사한 결과, E3-6 형질전환 감자는 두 제초제를 각각 단독으로 처리할 때나 혼합하여 동시 처리할 때에도 동일한 저항성이 나타남을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제17권9호통권89호
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• pp.1197-1203
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• 2007

세균인 Paenibacillus sp. DG-22의 유전체 DNA library가 제조되었으며, ${\beta}-xylosidase-$양성 클론이 형광기질인 $4-methylumbelliferyl-{\beta}-D-xylopyranoside$ $({\beta}MUX)$를 사용하여 확인되었다. 이 클론으로부터 재조합 플라스미드가 분리되었고 삽입된 4.3-kb 크기 DNA의 염기서열이 결정되었다. ${beta}-xylosidase$ 유전자는 분자량이 78.710 dal-ton이고 pI가 5.0인 701개의 아미노산을 암호화하는 2,106 염기쌍의 열린해독틀(ORF)로 구성되어있었다. xylA 유전자산물의 추론된 아미노산 서열은 과(family) 52에 속하는 클리코실 가수분해효소로 분류된 ${beta}-xylosidase$들과 상당한 유사성을 가지고 있었다. 이 xylA 유전자에 6개의 히스티딘-꼬리표를 붙이기 위해 pQE60 발현벡터에 다시 클로닝하였다. 재조합 ${beta}-xylosidase$ $(XylA-H_6)$가 열처리와 고정화금속친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 순수하게 정제되었다. $XylA-H_6$ 효소의 최적 pH와 온도는 각각 pH 5.5-6.0과 $60^{\circ}C$이었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제18권8호
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• pp.1386-1392
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• 2008

A gene (sll0158) putatively encoding a glycogen branching enzyme (GBE, E.C. 2.4.1.18) was cloned from Synechocystis sp. PCC6803, and the recombinant protein expressed and characterized. The PCR-amplified putative GBE gene was ligated into a pET-21a plasmid vector harboring a T7 promoter, and the recombinant DNA transformed into a host cell, E. coli BL21(DE3). The IPTG-induced enzymes were then extracted and purified using Ni-NTA affinity chromatography. The putative GBE gene was found to be composed of 2,310 nucleotides and encoded 770 amino acids, corresponding to approx. 90.7 kDa, as confirmed by SDS-PAGE and MALDI-TOF-MS analyses. The optimal conditions for GBE activity were investigated by measuring the absorbance change in iodine affinity, and shown to be pH 8.0 and $30^{\circ}C$ in a 50 mM glycine-NaOH buffer. The action pattern of the GBE on amylose, an $\alpha$-(1,4)-linked linear glucan, was analyzed using high-performance anion-exchange chromatography (HPAEC) after isoamylolysis. As a result, the GBE displayed $\alpha$-glucosyl transferring activity by cleaving the $\alpha$-(1,4)-linkages and transferring the cleaved maltoglycosyl moiety to form new $\alpha$-(1,6)-branch linkages. A time-course study of the GBE reaction was carried out with biosynthetic amylose (BSAM; $M_p{\cong}$8,000), and the changes in the branch-chain length distribution were evaluated. When increasing the reaction time up to 48 h, the weight- and number-average DP ($DP_w$ and $DP_n$) decreased from 19.6 to 8.7 and from 17.6 to 7.8, respectively. The molecular size ($M_p$, peak $M_w{\cong}2.45-2.75{\times}10^5$) of the GBE-reacted product from BSAM reached the size of amylose (AM) in botanical starch, yet the product was highly soluble and stable in water, unlike AM molecules. Thus, GBE-generated products can provide new food and non-food applications, owing to their unique physical properties.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제46권2호
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• pp.102-110
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• 2018

myo-Inositol (MI)을 대사하여 다른 물질로 전환하는 미생물을 과수원 토양으로부터 분리하였다. 분리균 YB-46은 유일한 탄소원으로 MI이 첨가된 배지에서 성장하였고 16S rDNA 염기서열에 따라 Enterobacter 속의 균주로 추정되었다. Fosmid pCC1FOS 벡터를 사용하여 제조된 거대 유전체 은행으로부터 MI을 미지의 대사 물질로 전환하는 Escherichia coli 형질전환주를 선발하였다. 이로부터 플라스미드를 분리하고 삽입된 유전자의 일부 염기서열을 결정한 결과 336 아미노 잔기로 구성된 myo-inositol dehytrogenase (IolG)를 암호화하는 iolG 유전자가 발견되었다. 분리균 YB-46의 IolG는 E. aerogenes와 Bacillus subtilis의 IolG와 약 50% 수준의 상동성을 보였다. 카르복실 말단에 hexahistidine이 연결되도록 제조한 His-tagged IoG (HtIolG)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtIolG를 정제하였다. 정제된 HtIolG는 $45^{\circ}C$와 pH 10.5에서 최대 활성을 보였고 MI과 D-glucose에 대한 활성이 가장 높았으며 D-chiro-inositol, D-mannitol 및 D-xylose에도 90% 이상의 활성을 보였다. 최적 반응조건에서 MI을 기질로 하여 반응 동력학적 계수를 측정한 결과 $K_m$과 $V_{max}$가 1.83 mM과 $0.724{\mu}mol/min/mg$로 확인되었다. HtIolG의 활성은 $Zn^{2+}$에 의해 1.7배 증가하였으며, $Co^{2+}$와 SDS에 의해서는 크게 감소하였다.