당뇨 합병증을 일으키는 중요 매체인 산화 스트레스에 대한 매생이 추출물과 그 지표물질인 pheophorbide a (PhA)의 정소 조직 내 산화 스트레스 보호 효과를 streptozotocin(STZ)에 의해 유발된 당뇨 쥐 모델에서 확인하였다. 당뇨를 유발하는 물질로 알려진 STZ를 40 mg/kg body weight(b.w.)의 농도로 복강 투여하여 당뇨를 일으킨 후, 매생이 추출물(CFE)샘플을 각각 4, 20 mg/kg b.w. 그리고 PhA를 0.2 mg/kg b.w.로 9 주간 투여하여 실험하였다. 정소 조직에서 산화 스트레스에 생성되는 체내 과산화물 지표인 혈액 nitric oxide와 지질 과산화물이 당뇨 유발군에 비해 CFE와 PhA 투여군에서 유의적인 감소를 보였으며, 체내 과산화물 축적을 제어하는 효소인 glutathione peroxidase, glutathione-S-transferase가 정상 수준으로 회복되었다. 또한, 체내 항산화 방어기작에서의 중요한 효소인 superoxide dismutase, catalase 활성 또한 샘플 투여 시 회복되는 것을 보아 CFE 투여군과 PhA투여군에서 조직 내 항산화 효소 조절과 함께 과산화물 축적 저해 효과를 통하여 당뇨 상태에서 고혈당에 의한 산화 스트레스가 일으키는 생식 조직 손상으로부터 매생이 추출물과 그 지표물질인 PhA는 보호 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
해양 미세조류는 해양생물의 영양원으로서 대부분 소비되고 있으며, 그 종류도 매우 다양하다. 이들 미세조류로부터 유용물질의 회수 및 이용은 미이용 수산자원의 효율적 이용과 아울러 생물 및 식량자원으로서 그리고 새로운 기능성 소재로서 활용될 수 있을 것이다. 본 연구에서는 이러한 해양 미세조류의 효율적인 이용을 위하여 비교적 성장이 빠르고 배양이 용이한 담녹조류인 T. suecica 중의 항산화성 물질을 분리정제하여 구조를 결정하였다. 미세조류 T. suecica의 유기용매 추출물 중의 항산화성은 chloroform 획분이 가장 좋았으며, 이 획분을 silica gel column chromatography, PTLC 및 HPLC를 사용하여 항산화성 물질을 분리${\cdot}$정제하였다. Silica gel column을 사용하여 분리된 획분의 항산화성은 hexane: ethylacetate (1:5)로 용출시킨 획분에서 가장 높았다. 이 획분은 PTLC에 전개하여 8개의 획분을 얻었으며, 그 중에서 Rf값 0.40인 획분에서 활성이 높게 나타났다 HPLC에서 단일 획분으로 정제된 물질의 항산화성은$IC_{50}$ 값으로 10.2$\mu$g/mL였으며, 화학적으로 합성된 항산화제인 BHT 및 BHA보다는 낮았지만 천연 항산화제인 $\alpha$-tocopherol과 비교될 수 있었다 이 물질의 화학적 구조는 chlorophyll을 전구체로 하는 pheophorbide-a로 동정되었으며, 항산화 활성은 a-tocopherol과 비교될 수 있어 식품 및 관련분야에서 항산화제로서 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
우리나라 고유의 전통발효식품으로서 장아찌류의 일종인 고추장아찌를 2가지 방법으로 제조하여 5$^{\circ}C$와 15$^{\circ}C$에서 보관 숙성시키면서 염도, pH, 아스코르브산, chlorophyll 및 그 유도체의 함량 변화를 조사하여 검토하였다. 장아찡의 염 농도는 담근원의 염도와 상관이 있었으며 저장온도가 높은 쪽이 염의 침투 속도가 빨랐다. 숙성 중 pH는 5$^{\circ}C$의 경우 완만한 감소를 나타냈으나 15$^{\circ}C$의 경우는 된장 담금은 32일째부터 pH 5.0 이하로 낮아졌다. 아스코르브산의 함량은 숙성기간이 경과됨에 따라 감소되었는데 특히 15$^{\circ}C$에서 된장 담금인 경우에 보다 급속하게 감소되어 16일째에 잔존율이 2% 정도였고 그 이후로는 소실되었다. 고추장아찌가 숙성됨에 따라 chlorophyll a 및 chlorophyll b의 함량은 크게 감소되었고, pheophytin과 pheophorbide a의 함량은 크게 증가되었는데, 이는 된장 담금인 경우가 간장 담금한 경우보다 그 정도가 크게 나타났다. 특히 아스코르브산의 함량과 chlorophyll 분해율과의 관계를 검토해보면 아스코르브산이 급격하게 파괴됨에 따라 chlorophyll 분해도 급속하게 일어났으며 pheophorbide 생성량도 빠른 속도로 증가됨을 알 수 있었다.
Regioselective 3$^1$-$^{18}$ O-labelling of chlorophyll derivatives possessing a 3-formyl group such as methyl (pyro) pheophorbide-d (3, 4) was carried out efficiently by a simple one-step procedure; by stirring a homogeneous solution of tetrahydrofuran and H$_2$$^{18}$ O containing a small amount of trifuluoroacetic acid.
본 연구에서 우리는 들깻잎(Perilla frutescens)으로부터 U937 세포에 대해 apoptosis를 유도하는 광과민성 물질을 분리하기 위해 연구를 시작하였다. 들깻잎은 한국의 대중적인 쌈채소로 바타민, GABA, 미네랄 등이 풍부하다고 알려져 있다. 건조한 들깻잎을 메탄올로 추출하여 다양한 크로마토그래피법을 이용하여 광과민성 물질을 순수 분리하였다. 순수 분리한 광과민성 물질을 PL9443으로 명명하고, 구조동정을 위하여 1D-NMR, 2D-NMR, FAB-mass spectroscopy 분석을 실시하였다. 순수 분리한 PL9443 compound의 흡광도를 측정한 결과 410 nm에서 최대 흡수를 보였고, 330, 410, 680 nm에서 흡수 peak를 나타내었다. PL9443 compound는 분자량 620.7의 pheophorbide a ethyl ester로 동정하였다. 구조동정한 물질은 porphyrin환을 갖는 구조에서 Mg이온이 탈리된 pheophorbide 유도체화합물이었다. PL9443 compound의 처리에 따른 U937 세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 광조건에서 apoptosis의 전형적인 현상인 apoptotic body와 소낭구조물이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 PL9443 compound를 0.08 nM로 처리하였을 때 99%의 caspase-3/7 activity가 나타났고, 세포손상 역시 광의존적으로 나타내는 것을 확인하였다. PL9443 compound를 처리하고 광을 조사한 처리구와 광을 조사하지 않은 처리구의 세포로부터 DNA를 분리하여 전기영동을 실시한 결과 광을 조사한 곳에서 DNA ladder현상을 관찰할 수 있었다. 따라서 PL9443 compound는 광의존적 apoptosis 유도에 의한 세포손상을 일으키는 것을 확인하였다.
국내에서 자생하는 P. thunbergiana 잎의 메탄올 추출물로부터 사람의 간암세포주, SK-HEP-1에 apoptosis를 유도하는 광과민성물질을 찾기 위해 연구를 시작하였다. Apoptosis를 유도하는 광과민성물질을 순수분리하기 위해 column chromatography법과 TLC법을 이용하였으며, 순수분리한 물질의 구조동정을 위하여 1D-NMR과 2D-NMR 및 FAB-MS분석을 실시하였다. P. thunbergiana 잎으로부터 크로마토그래피법을 이용해 순수분리한 M4-3 화합물의 흡광도를 측정한 결과 410 nm에서 최대 흡수를 보였고, 668, 502, 533, 607 nm에서 흡수 peak가 나타나는 녹색의 물질로 chlorophyll a, b와는 다른 물질이었다. FAB-MS 분석결과와 NMR 분석결과, 분자량 622의 132-hydroxy pheophorbide a methyl ester($C_{36}H_{28}N_2O_6$) 화합물로 porphyrin 환으로부터 Mg이온이 떨어져나간 pheophorbide a유도체화합물로 동정되었다. M4-3화합물을 SK-HEP-1세포에 대한 세포독성을 조사한 결과, 0.04 ${\mu}M$ 농도로 처리한 곳에서는 40% 세포증식 억제효과가 나타났고, 0.08 ${\mu}M$ 농도로 처리한 곳에서는 80% 세포증식 억제효과가 나타나 농도의존적이었다. 그리고 M4-3화합물을 동일한 농도로 처리하고, 광의 조사 유무에 따른 활성차이를 조사한 결과, 광을 조사한 곳에서만 세포독성이 나타났기 때문에 M4-3화합물은 광과민성물질이라는 것을 알 수 있었다. M4-3화합물을 처리하고 세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 핵이 응축되었고, 소낭이 형성되었으며, DNA 단편화가 일어나는 등 apoptosis의 대표적인 현상들이 일어났기 때문에 M4-3화합물의 세포사멸은 광역학활성에 의한 apoptosis유도로 확인하였다.
배추를 가열 처리했을 때와 친치를 제조하여 산발효시켰을 때에 시간의 경과에 따른 chlorophylls의 변화와 pH의 변화를 조사하였다. 가열했을 때에는 pheophytins의 생성이 뚜렷했고, 이것은 pH의 감소경향과 관계있으며, 1분간 가열했을 경우에는 chlorophyllase의 활성화에 의해 chlorophyllides의 생성이 촉진되었다. 김치의 경우는 숙성초기에 pH변화에 따라 chlorophylls의 함량이 급격히 감소했으며, 숙성말기에는 pheophytins와 pheophorbiaes만 존재했고, 가열한 경우에 비해 pheophorbides의 생성이 뚜렷했지만 pheophytins보다는 낮은 수준이었다.
당뇨 모델 쥐에서 매생이 추출물과 그 지표물질인 pheophorbide A의 신장 보호 효과를 확인하였다. 5주령의 SD 랫드를 일주일간 순화시킨 뒤 40 mg/kg BW의 농도로 streptozotocin을 복강 투여하였으며, 한달 동안의 유도기간을 거쳐 모든 당뇨 유발군에서 혈당이 400-500 mg/dL가 된 것을 확인한 이후 9주 동안의 샘플 투여를 진행하였다. 신장 손상과 관련한 혈액 생화학적 지표인 BUN, creatinine에서는 당뇨 유발군 사이에 개선되는 경향을 보이진 않았다. 신장 조직에서 산화스트레스에 의해 유발되는 지질 과산화물을 측정 하였을 때 당뇨 유발군인 STZ군($0.19{\pm}0.04$)은 정상 대조군인 Con군($0.05{\pm}0.00$)에 비하여 3.5배 많은 MDA를 생성하였지만 매생이 추출물 4, 20 mg/kg BW투여한 CL, CH군은 MDA의 생성량이 $0.05{\pm}0.02$, $0.08{\pm}0.02$, 지표물질인 pheophorbide A를 0.2 mg/kg BW을 투여한 PhA군은 0.12{\pm}0.01 nmol/mg protein로 샘플 투여군에서 과산화물이 유의적으로 감소하는 것으로 보아(p<0.05) CFE와 PhA의 항산화 작용을 확인할 수 있었다. 항산화 바이오 마커인 GSH와 GSSH 함량 및 GPx, GR, GST 활성을 측정한 결과 CFE와 PhA는 산화스트레스에 의한 신장 조직의 GSH 함량이 감소하는 것을 막아 당뇨로 인한 신장 손상에 보호 효과가 있는 것을 확인하였다(p<0.05). 또한 STZ에 유도된 당뇨 쥐의 신장 조직엔 많은 양의 과산화물이 축적되어 있으며 이를 소거하기 위해 GPx의 활성이 높아졌는데, AC군과 PhA군에서 GPx 의 증가 정도를 유의적으로 완화시켰다(p<0.05). GR 활성은 CL, CH, PhA군에서 Con군 수준까지 올라오는 것으로 보아 신장의 산화적 손상을 정상수준까지 회복 시키는 것으로 보였으며, GST 결과로 미루어 보아 CFE와 PhA는 신장 조직에서 일차적으로 과산화물을 포집하고 GSH를 이용하여 체내의 독성 물질을 분해시켜 STZ로 유도된 당뇨로부터 신장 보호 효과를 나타내었다. 또한, 조직 내에서 SOD와 CAT의 활성 측정 결과, CFE와 PhA는 지질과산화물의 증가로 산화적 손상이 가속화 될 때, 항산화 효소계의 활성을 증가시키고 산화 스트레스에 의한 조직 손상을 완화 시켜 주는 것으로 확인되었다. 신장 조직의 병리학적 관찰 결과 CL, CH 및 PhA군에선 STZ군에 비해 비이상적인 글리코겐의 축적이 유의적으로 저해 되는 것을 관찰할 수 있었다(p<0.05). 위와 같은 실험 결과를 통하여 매생이 추출물과 PhA가 당뇨병성 신장 손상에 보호 효과가 있다는 것을 확인하였다.
각종 부재료를 각각으로 첨가한 절임배추를 제조하여 5$^{\circ}C$와 15$^{\circ}C$에서 13일간 저 장하면서 pH, 산도 및 아스코르브산의 함량변화를 측정하고 chlorophyll분해 및 그 유도체 의 생성과의 증가는 온도가 높을수록 뚜렷하여 온도와의 관련성이 높은 것으로 나타났고, 첨가한 부재료의 영향을 보면 마늘, 고춧가루 및 젓갈은 pH의 저하나 산도의 증가를 촉진 하였고, 파와 생강은 큰 영향없이 나타났다. 5$^{\circ}C$ 및 15$^{\circ}C$의 발효기간 중 아스코로브산의 잔 존량은 대체적으로 갓을 첨가한 절임배추가 가장 낮게 나타났다. Chlorophyll의 분해는 발효 기간 중 대체로 아스코르브산의 함량이 높았던 갓을 첨가한 절임배추에서 낮은 경향을 보였 으나 발효기간중 아스코르브산의 잔종량이 전반적으로 높았던 마늘을 첨가한 절임배추에서 chlorophyll의 분해가 심하였고, pheophytin과 pheophorbide 생성량이 크게 증가하는 것으로 나타났는데 이는 산도의 증가와 pH의 감소가 가장 크게 나타난 것과 일치되었다. 따라서 발효중의 chlorophyll의 분해는 아스코르브산 함량변화와도 연관이 있을뿐만 아니라역시 산 의 생성에 의한 pH의 감소와 관련성이 있었다.
갈조류중의 발암 promotion 억제인자를 밝히기 위하여 곰피, 미역 및 다시마의 용매추출물을 이용하여 발암 promotion 억제효과를 조사한 결과, 곰피. 미역 및 다시마의 수용성 추출물을 제외한 유기용매 분획물에서 우수한 억제효과를 나타내었다. 이 중에서 억제효과가 강한 곰피를 이용하여 발암 promotion 억제인자를 살펴본 결과, 곰피중의 bromophenol, phloroglucinol 등의 phenol 을 비롯하여 chlorophyll 및 carotenoid 화합물에서 억제 효과가 높게 나타났다. 곰피의 chlorophyll a 및 pheophorbide a에서 5 $\mu$M 첨가시 $77.4\%$ 및 $66.6\%$의 억제효과가 나타났으며, 곰피의 carotenoid 화물 중에서는 lutein, $\alpha$-cryptoxanthin 및 $\beta$-carotene이 주요 억제인자로 밝혀졌다. Lutein 및 $\alpha$-cryptoxanthin 의 발암 promotion 억제효과는 20$\mu$g 첨가에 의해 각각 $76.9\%$ 및 $84.4\%$로 우수하였고, 세포 생잔율도 높게 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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