본 연구에서는 R rubrum을 이용한 석탄합성 가스로부터 수소 생산공정에 있어서의 세포성장 및 일산화탄소 전환을 최적화하 는 여러 조건들을 조사하였다. 그 중 pH의 영향을 살펴보면 R. rubrum 세포성장에는 pH 6~7이 최적이었고 수소생산에는 pH 7 7-7.5이 최적이었으며 pH가 5.5에서는 세포성장이거의 이루어 지지 않았다. 또한 온도가 34 'C 이상 증가되었을 때 세포성장이 둔화되어 멈추고 안정적인 co 전환속도를 얻을 수 없으므로 $30^{\circ}C$가 R. rubrum 균주 성장과 co 전환에 최적온도라 생각된다. 또한 R. rubrum은 photosynthetic bacteria인데 이 세포의 성장에 는 벚의 세기가 1,700-2,400 Lux가 최적임을 알 수 있었고 co 전환에는 계속적인 빛의 공급이 꼭 필요하지는 않고 간헐적인 빛의 노출만으로도 충분하다고 생각된다. 또한 연속반응기를 이 용하여 600 rpm, $30^{\circ}C$, pH 7에서 합성가스 체류시간 110분시 co 전환율 약 53%정도를 얻을 수 있었다. 이 연구가 계속 진 행되어져서 photobioreactor의 개발, high pressure bioreactor의 이 용, 균주의 mutatIOn 및 전환능력 우수 균주 등의 selection을 수 행한다면 매우 높은 합성가스 전환율을 갖는 생물반응기 공정개 발도 가능하리라 생각된다.
본 연구는 혐기성 발효를 이용한 수소생산과정에서 pH를 일정하게 유지한 상태에서 안정적인 수소를 생산하기 위한 최적 pH를 찾고자 하였다. 실험결과 pH 6이었을 때 최적의 조건이었으며 이때 수소생산량은 1175.87 mL/L 이고, 이론적 수소 전환율은 22.51 %였다. pH 5는 901.77 mL/L의 수소가 발생되었으며, 수소 전환율은 17.48 %, pH 7은 454.26 mL/L의 수소생산량과 8.74 %의 수소 전환율을 나타내었다. 그리고 pH 7과 8에서는 각각 452.08 mL/L와 82.25 mL/L의 저조한 수소 생산량을 나타내었다. 자당의 혐기성 발효를 통한 유기산 생성에 있어서 pH가 7과 8에서는 propionate가 주로 관찰되었으나 pH가 5와 6인 영역 에서는 butyrate의 생성이 두드러지는 결과가 나타났다.
본 연구에서는 인간에게 유용한 여러 생리적 기능을 갖는 Human lactoferrin (hLf)을 대량생산할 목적으로 동물 세포의 단백질을 안정하게 생산 및 분비할 수 있는 진핵생물인 효모 sacduraromyces diastaticus YIY345에 hLf 유전자를 도입하여 hLf의 발현 및 분비를 시도하였다. 1. hLf의 발현 및 분비를 위하여 STA1 (S. diasticus glucoamylase) 유전자의 promoter 및 분비 신호와 hLf 전사 종결을 위한 GAL7(galactose utilizing gene) transcriptional terminator하에 재조합 plasmid pYEGLf를 제작하였다. 2. 제작한 plasmid를 선별하고 증폭하기 위하여 대장균에 형질 전환하였고 대장균 형질전환체로부터 plasmid를 분리하여 적당한 제한 효소로 처리하고 크기를 확인하였다. 최종적으로 선별된 plasmid는 효모 S. diastaticus YIY345에 형질 전환시켜 효모 형질전환체를 얻었다. 3. 효모 형질전환체를 Western hybridization으로 단백질 수준에서 분석한 결과 pYEGLf가 도입된 형질전환체에서 hLf가 생산되어 세포외로 분비되었다. 4. hLf가 발현된 효모 형질전환체의 배양상등액을 paper disc법을 이용하여 E.coli에 대한 항균 효과를 측정하였으나 관찰할 수 없었다. E.coli에 대한 hLf의 MIC (minimal inhibitory concentration)는 약 $3000{\mu}g/m{\ell}$에 비해 효모에서 분비하는 hLf의 양은 상당히 적으므로 항균효과를 측정하기 불가능하다. 그러므로 정제 단계를 거쳐 더 높은 농도로 처리해야 할 것이다.
인삼사포닌 ginsenoside는 인삼의 주요한 약리성분으로 인삼을 경구투여 시 major 사포닌의 생체 내에서의 흡수는 매우 낮아 인삼사포닌의 약효를 증대시키기 위해서 기존에 많이 존재하는 major 사포닌을 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 minor 사포닌으로의 전환이 요구된다. 본 연구는 김치에서 분리한 ${\beta}-glucosidase$ 활성균주 L. brevis LH8이 분비하는 효소를 이용하여 ginsenoside Rd를 compound K로 전환시켰다. L. brevis LH8의 효소액은 반응 온도 $30^{\circ}C$에서 효소활성이 가장 좋았고 $35^{\circ}C$이상에서는 활성이 급격히 저하되었으며, pH $6.0{\sim}12.0$ 사이에서 효소활성이 가장 좋았고, pH 5.0 이하 및 pH 13.0 이상에서는 활성도가 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 ginsenoside Rd는 반응 48시간부터 ginsenoside F2로 전환되기 시작하였으며, 반응 72 시간 이후에는 대부분 compound K로 전환되었다.
Fe-EDTA 착물을 이용한 황화수소 제거의 최적 반응 조건을 기포탑 반응기에서 조사하였다. 착물의 농도가 증가할수록 황화수소 산화 반응에서 전환량은 증가하였고 pH 변화와 Fe 농도는 완만하게 감소하였으며, elemental sulfur의 생성량은 증가하였다. 또한 황화수소는 0.05M 이상의 착물 농도에서 효율적으로 제거되었다. pH에 따른 황화수소 산화반응에서 pH는 착물의 안정도에 중요한 인자이고 반응 중 최적 pH 범위는 8.5~9.5 이었다. [EDTA]/[Fe] 비가 증가할수록 황화수소 산화 반응의 전환량은 증가하였고 반응 중 EDTA 농도가 감소하면 FeS로 침전이 촉진되어 전환량은 감소하였다. 즉 EDTA 농도가 증가될수록 Fe-EDTA 착물이 안정되어 전환량이 증가하였다.
1.형질전환 조건 설정: 페염균을 casein hydrolysate배지에서 배양하여 550nm에서의 흡광도가 0.1이 되었을 때 pH를 7.0으로 낮추고 형질전환 능력이 나타나도록 할 때에는 pH를 7.6으로 높여 줌으로써 형질전환이 원하는 시기에 발현되도록 함. 2.돌연변이원에 대한 감수성 측정: com- mutant는 야생형보다 돌연변이가 일어난 위치에 따라 UV에 대한 감수성의 차이가 나타났으나 EMS에 대해서는 야생형과 큰 차이가 얼었음. 3.온도민감성: 5시간동안 43$^{\circ}C$에서는 37$^{\circ}C$에서의 생장율의 5%만 증가되었으나 5$0^{\circ}C$에서는 전혀 성장하지 않음.
제초제 propanil(3',4'-dichloropropionanilide)과 그 분해산물인 DCA(3,4-dichloroaniline)가 laccase, horseradish peroxidase(HRP) 및 birnessite에 의하여 중개된 oxidative coupling에 의하여 토양 유기물의 구성성분에 병합될 수 있는지를 알기 위하여 토양 유기물의 monomer들과의 반응성을 조사하였다. Propanil 또는 DCA가 단독으로 존재하는 반응조건에서는 산화환원촉매들에 의하여 이들의 전환이 거의 이루어지지 않았거나 상당히 낮은 수준이었다. 그러나 humic monomer들이 있을 때 laccase와 HRP의 경우 propanil은 syringic acid와 DCA는 catechol과 높은 전환율을 나타내었으며, birnessite의 경우 DCA는 protocatechuic acid와 높은 전환율을 나타내었다. DCA의 전환율은 laccase의 경우 catechol과 pH 8.0에서 24시간 동안 반응시킬 때, HRP의 경우 catechol과 pH 3.0에서 2시간 동안 반응시킬 때 가장 높았고, birnessite의 경우 protocatechuic acid와 pH 5.0에서 2시간 동안 반응시킬 때 가장 높았다. Humic monomer의 농도를 증가시킬수록 DCA의 전환율도 증가하였다. Humic monomer 대신 dissolved organic carbon(DOC)이 있을 때 laccase는 DCA를 거의 전환시키지 못 하였으나, HRP는 DCA의 전환율을 크게 증가시켰고, birnessite는 큰 영향을 미치지 않았다. DCA의 전환율은 laccase 단독으로 있을 때 보다 birnessite와 공존할 경우 약 5배 가량 증가된 반면, HRP와 birnessite가 공존할 경우에는 증가되지 않았다.
Alcaligenes eutrophus A52의 무세포 추출액으로부터 유안염석 및 DEAE-cellulose 이온교환 크로마토그래피로서 D-$\alpha$-Amino-$\varepsilon$-Caprolactam(DAC) racemase 와 L-$\alpha$-Amino-$\varepsilon$-Caprolactam(LAC) hydrolase를 분획하였다. A. eutrophus A52에 의한 DAC로부터 L-lysine으로의 전환은 DAC가 racemase에 의해 LAC로 전환된 후 hydrolase에 의해 L-lysine으로 가수분해됨을 확인하였다. DEAE-cellulose 이온교환 크로마토그래피에 의해 분리된 racemase의 분획은 최적온도가 55$^{\circ}C$, 최적 pH는 8.0이었으며 hydrolase의 분획은 최적온도가 $65^{\circ}C$ 최적 pH가 9.0이었다. 이 두 효소를 모두 함유하는 무세포 추출 액에 의한 DAC로부터 L-lysine으로의 전환은 6$0^{\circ}C$와 pH8.5에서 최대를 나타내었고 2% 이상의 DAC와 L-lysine에 의해 상당한 저해를 받았으나 0.5% DAC를 3.1mg의 단백질에 상당하는 무세포 추출액으로서 전환시킨 결과 55$^{\circ}C$에서 10시간 동안에 약 98%가 L-lysine으로 전환되었다.
전처리 후 얻어진 셀룰로스 고분자를 단당류로 전환하기 위해서는 셀룰라제를 이용한 당화 과정이 필요하다. 통상 실험식 연구에서는 셀룰로스 당화시 당수율을 최대로 하기위해 pH조절을 위한 Citrate buffer와 미생물 오염을 막기 위한 Autoclave에서의 멸균 과정을 거친다. 하지만 대량생산을 목적으로 하는 산업체에서는 적용이 어렵다는 문제점이 있다. 따라서 본 연구에서 이를 대신하여 산업체에서 적용 가능한 당화전환 공정의 효율성을 평가하고자 하였다. Autoclave 멸균을 대체하는 공정으로 항생제 첨가와 여과에 의한 제균을 선택하였고, citrate buffer를 대신하여 buffer를 첨가하지 않은 물을 pH를 조정하여 사용 하였다.실험결과 기존의 당화공정을 사용하였을 때 당화율이 81%이었고, pH를 조절한 제균 water에 항생제를 첨가하는 공정은 71%로 나머지 배지들 중 가장 높은 당화율을 나타냈다. 이것은 기존의 당화율보다 10% 낮은 수치이나 공정비를 교려하여 봤을 때 효율성 있는 공정으로 판단된다.
Pnicillinase를 분필하는 Streptomyces bobili YS-40균주의 plasmid DNA를 phemol방법으로 유출하여 Bocillus subtilis IAM 12118균주에 형질 전환시켜서 penicillin 내성 plasmid DNA가 표현되게 하였다. 형질전환에 미치는 최적 pH와 온도는 각각 7.0, 3$0^{\circ}C$으로 나타났다. DNA와 Competent cell을 20분 이상 접촉시킴으로서 형질전환이 잘 일어났으며 DNA의 농도가 증가할수록 transformant의 수도 증가했다. DNA inhibitor 로 사용되는 lysine 의 첨가로 형질전환의 빈도가 약 6배정도 상승되었으며 chloramphenicol은 형질전환의 빈도에 별 영향을 미치지 않았다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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