• 미생물학회지
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• 제37권4호
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• pp.245-252
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• 2001

MLS (macrolide-lincosamide-streptogramin B) 항생제 내성인자 단백질인 Erm 단백질들은 아미노산 서열 중 그 동일성과 유사성이 높아 구조적으로도 동등한 단백질의 한 집단을 형성한다. 최근 X-ray crystallography에 의해 구조가 결정된 ErmC\` 및 ErmAM 단백질의 구조에 근거하여 ErmSF 단백질도 catalytic domain과 substrate binding domain으로 구분하였고 N-terminal end에 존재하는 catalytic domain의 대량생산을 다양한 pET 발현 vector를 사용하여 시도하였다. 그리고 catalytic domain을 coding하는 DNA 절편은 세 종류를 사용하였다: DNA 절편 1은 Met 1부터 Glu 186까지를 coding하고 DNA 절편 2는 Arg 60부터 Glu 186까지의 정보를 가진 DNA이고 DNA 절편 3은 Arg 60부터 Arg 240까지를 encoding하는 DNA이다. 사용된 다양한 발현 vector중에서 pET19b는 DNA 절편 3, pET23b는 DNA 절편 1과 2를 성공적으로 대량생산하였다. 그러나 대량생산된 catalytic domain들은 불용성 단백질 집합체인 inclusion body를 형성하였다. ErmSF catalytic domain들의 용해성 단백질의 생산을 위하여 chaperone GroESL과 Thioredoxin의 동시 발현 및 배양온도를 $22^{\circ}C$로 낮추어 시도했으나 대량 발현된 단백질의 용해에는 도움을 얻지 못하였다.

• 미생물학회지
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• 제38권4호
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• pp.318-321
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• 2002

토양 등의 인 제한환경에서 특이적으로 발현하는 벡터를 구축하기 위해서 Enterobacter areogenes의 phoA 유전자의 promoter가 든 pEAAP를 구축하였다. pEAAP는 pET-22b(+)을 BglII와 XbaI으로 절단하여 T7 promoter와 lac operator를 제거하고pho box가 포함된 phoA promoter를 삽입하여 구축하였다. pEAAP가 인 제한 환경에서 특이적으로 발현되는지 조사하고자 Bacillus subtillis var. amyloliquefaciens (KCTC 8913P)의 Phytase유전자인 Bsa-phy1을 도입한 pEAPHY1을 구축하였다. CK-PHY1 (pEAPHY1을 도입한Escherichia coli JM109)는 인 제한 환경에서 41 kD)의 Bsa-Phy1을 발현하였다. 또한, CK-PHY1은 phytate를 유일한 인산원으로 첨가된 고체배지에서 phytate를 분해하여 투명대를 형성하였다.

• Journal of Microbiology
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• 제45권6호
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• pp.593-596
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• 2007

In this study, we describe the development of a simple and efficient method for cell lysis via the insertion of a bacteriophage lambda lysis gene cluster into the pET22b expression vector in the following order; the T7 promoter, a gene for a target protein intended for production, Sam7 and R. This insertion of R and Sam7 into pET22b exerted no detrimental effects on cellular growth or the production of a target protein. The induction of the T7 promoter did not in itself result in the autolysis of cells in culture but the harvested cells were readily broken by freezing and thawing. We compared the efficiency of the cell lysis technique by freezing and thawing to that observed with sonication, and determined that both methods completely disintegrated the cells and released proteins into the solution. With our modification of pET22b, the lysis of cells became quite simple, efficient, and reliable. This strategy may prove useful for a broad variety of applications, particularly in experiments requiring extensive cell breakage, including library screening and culture condition exploration, in addition to protein purification.

• KSBB Journal
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• 제24권6호
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• pp.591-597
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• 2009

심장이상증상의 상태에서 분비되는 심장혈관호르몬인 BNP의 혈중 농도측정은 심장기능부전환자의 진단에 유용하게 이용 되고 있다. 혈청 또는 혈장에서의 BNP 농도측정은 샌드위치형태의 면역학적 검정법을 이용할 수 있으며, 이때에 항 BNP 항체를 BNP 탐지 인자로 사용할 수 있다. 특히, 탐지 인자로의 사용을 위해서는 항원항체 반응부분을 링커로 연결하여 전체 항체에 비해서 경제적이며 효율 면에서도 뛰어난 scFv의 사용이 용이하다고 판단하였고, 이에 scFv의 취약점인 대장균에서의 불용성 형태의 발현을 최소화 시키고 기능적 발현을 극대화하여 심장질환 진단용 센서의 센서 칩 항체로 사용할 수 있도록 항 BNP scFv 항체의 발현을 대장균 세포질 내에서 유도 하였다. 대장균 세포질내에서의 scFv 제작을 위하여 항 BNP scFv 항체 유전자를 pColdⅣ 벡터와 pET22b (+)벡터에 각각 클로닝한 후 발현 하였으며, 그 결과 대량 생산의 장점이 있는 강력한 T7 promoter를 지닌 pET22b (+) 벡터를 이용하여 낮은 온도에서 단백질의 발현을 느리게 유도할 때 적절한 단백질 접힘 현상이 일어나 기능적인 scFv의 발현이 극대화됨을 확인하였다. 또한 IPTG의 투여에 있어서 그 농도가 높아지면 빠른 단백질 유전자의 전사를 도와 발현율이 증가하지만 과도한 농도의 IPTG 투여는 세포내의 독성을 일으켜 단백질의 생산을 저해할 수 있다는 결론에 도달하였으며, 연구를 통하여 개발한 항 BNP scFv 항체가 오직 BNP 항원과의 결합특이성을 가진다는 사실도 확인 가능 하였다.

• Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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• 제40권4호
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• pp.211-217
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• 2006

재조합된 scFv lym-1의 세포결합 실험에서 높은 면역반응성을 보였으며, 비특이 반응에서 모항체인 IgG lym-1에 의해 결합이 억제됨을 확인하였고, 동물 영상을 통해 IgG보다 분자랑이 작은 scFv lym-1 항체가 빠른 체내대사율과 종양섭취율을 보여 방사면역진단에 유용할 것으로 보여진다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제13권5호
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• pp.660-665
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• 2003

High-level expression of Thermus caldophilus GK24 alkaline phosphatase (Tca APase) was achieved in Escherichia coli using the pET-based expression plasmids, pEAP1 and pEAP2. In the case of plasmid pEAP2, the signal peptide region of Tca APase was replaced by the PelB leader peptide of expression vector pET-22b(+). Furthermore, the expression level was somewhat higher than that of plasmid pEAPl. A rapid purification procedure of Tca APase overproduced in E. coli was developed which involved heating to denature E. coli proteins followed by HiTrap Heparin HP column chromatography. Optimal temperature and pH and $Mg^{2+}$ dependence of the recombinant Tca APase were similar to those of native enzyme isolated from T. caldophilus GK24.

• 한국어업기술학회:학술대회논문집
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• 한국어업기술학회 2000년도 춘계수산관련학회 공동학술대회발표요지집
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• pp.161-162
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• 2000

Metalloprotease produced in Vibrio mimicus, in which zinc is an essential meta ion for catalytic activity, degrades a variety of biologically important substances including human collagen, several complement components, and immunoglobulin. For gene overexpression and convenient purification, VMC gene was constructed in pET22b(+) expression vector by using of PCR. (omitted)

• Journal of Dairy Science and Biotechnology
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• 제29권1호
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• pp.49-54
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• 2011

담즙산 분해효소(Bile salt hydrolase, EC 3.5.1.24) 활성은 담즙산의 카르복실기와 결합되어 있는 아미노기(glycine or taurine)와의 amide 결합을 끊는 작용을 하며, 이 효소 활성은 사람이나 동물의 장내 미생물들에서 널리 분포하고 있다. 노인 분변으로부터 분리한 여러 균주의 Enterococcus faecalis중에서 BSH activity가 가장 높은 CU30-2를 선발하였다. BSH 유전자를 pET22b expression vector에 클로닝하여 Escherichia coli BL21(DE3) Gold를 이용하여 단백질을 발현하였다. 6x His-tag이 있는 BSH 효소를 $Ni^+$-NTA agarose column을 이용하여 분리 정제하였고, 6가지의 다른 담즙산염을 이용하여 기질 특이성을 비교하였다. E. faecalis CU30-2의 BSH 효소는 glycine이 결합된 담즙산염에 대한 효소활성이 taurine이 결합된 것에 대한 활성보다 약 50배 정도 높게 나타났다. 이 효소의 최적 pH와 온도는 각각 7.0과 40$^{\circ}C$로 확인되었다.

• 산업기술연구
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• 제29권A호
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• pp.169-176
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• 2009

The gene encoding endoxylanase (xylS) was isolated from a genomic library of Bacillus licheniformis NBL420. Two positive clones, which harbor 1.5 kb and 0.8 kb inserts respectively, were screened on RBB dyed-xylan plates and the recombinant plasmids were named as pBX3 and pBX5. The nucleotide sequencings of two inserts revealed the existence of common 639 bp of open reading frame which encode 232 amino acids. The xylS gene was successfully subcloned into pET22b(+) vector and overexpressed. Enzymatic properties including optimum pH, optimum temp, thermostability and pH stability were investigated. Activity staining of XylS was identical with that of original Bacillus licheniformis NBL420.

• 산업기술연구
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• 제29권A호
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• pp.161-167
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• 2009

The bifunctional Xylanase-Cellulase hybrid protein was constructed by gene fusion. Two genes corresponding to endoxylanase gene (xylS) and endocellulase gene (celA) were amplified by PCR from Bacillus licleniformis NBL420. It was then linked through splicing by overlap extension (SOE) by PCR method. The two resulting fused hybrids, xyl/cel and cel/xyl, which differ by its orientation, were confirmed by its nucleotide sequencings. One of two fusion genes, xyl/cel was successfully expressed into pET22b(+) vector (pxyl/cel) with bifunctional xylanase-cellulase activity. On the contrary, the other cel/xyl fusion protein showed only cellulase activity with much decreased xylanase activity. Enzymatic properties of Xyl/Cel fusion protein were investigated regarding optimum pH, optimum temp, thermostability, and pH stability. It was revealed that Xyl/Cel fusion protein retained the bifunctional xylanase-cellulase activities eventhough two enzymes were connected with each other directly. These informations could be useful for construction of other hybrid proteins as well as increased range of substrate utilization.