• 생명과학회지
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• 제28권4호
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• pp.389-397
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• 2018

당 단백질에 붙어 있는 당사슬 구조는 형질전환 돼지 유즙으로 분비되는 의약용 단백질의 생물학적 활성, 안정성 그리고 안전성에 영향을 줄 수 있다. 형질전환 동물을 이용한 치료용 당 단백질 생산은 유선 세포에서 이루어지는 당사슬 부가능력에 의해 제한되며, 균일한 당사슬 형태를 가지는 당 단백질 생산은 도전 과제로 남아있다. ${\beta}$-1,3-N-acetylglucosaminylatransferase1 (B3GNT1) 유전자는 N-아세틸글루코사민에 갈락토오스 잔기를 부착시키는 단백질 당화기작에 중요한 효소이지만, 돼지 당 전이효소에 대한 정보는 매우 제한적이다. 따라서, 돼지 B3GNT1 (pB3GNT1) 유전자를 클로닝하고 N-아세틸글루코사민에 갈락토오스 잔기를 부착시키는 기능적 특성을 조사하였다. 몇가지 다른 프라이머를 사용하여 전체 전사영역(ORF)을 함유하는 부분적인 pB3GNT1 mRNA 염기서열을 간 조직으로부터 분리하였다. 클로닝 된 pB3GNT1의 ORF는 1,248개의 뉴클레오티드를 가지며, 415개 아미노산 잔기로 구성되어 있었다. pB3GNT1 유전자의 장기별 발현특성은 성돈 및 자돈의 여러 기관에서 분석하였다. pB3GNT1 mRNA 발현 수준은 심장, 소장 보다는 근육에서 높았지만 폐에서는 낮았다. pB3GNT1의 기능적 특성 분석을 위해 돼지 신장 세포주(PK-15)에서 pB3GNT1 유전자의 안정적인 발현을 확립하였다. 그 결과, PK-15 세포에서 pB3GNT1 발현에 의한 당화 패턴은 총 시알산 증가에는 영향을 미치지 않지만, poly-N-아세틸글루코사민은 증가하는 것으로 나타났다. 본 연구는 생물반응기로 형질전환 돼지를 이용할 때 희망하는 당사슬을 부가하여 치료 가능성을 높이며 개선된 활성을 나타내는 당단백질 생산에 도움이 될 것이다.

• 원예과학기술지
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• 제30권2호
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• pp.162-170
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• 2012

스프레이 국화품종 'Argus'와 감마선 조사에 의해 화색변이가 일어난 돌연변이체의 꽃잎으로부터 안토시아닌 생합성 경로에서 중요한 역할을 담당하는 신규 $DgF3'H$의 전장 cDNA와 genomic DNA를 분리하였다. 전장 cDNA는 1,527bp(509 아미노산)의 ORF를 포함하고 있으며, 원품종 'Argus'와 화색변이체 사이의 염기서열 상동성은 97% 이상을 나타내었다. Genomic DNA의 크기는 야생형 'Argus'에서 3,831bp이었고, 3가지 화색 변이체에서는 3,828부터 3,838bp의 크기를 나타내었다. $DgF3'H$ 유전자는 세 개의 exon사이에 두개의 intron을 갖고 있는 구조이고, 3'과 5' UTR 부분을 제외한 intron의 크기는 야생형 'Argus'에서 2,157bp이지만 3가지 화색 변이체에서는 2,155부터 2,159bp의 크기를 갖고 있었다. 이것은 감마선 조사에 의해 intron 부분의 유전자가 결실 또는 삽입된 것으로 추정된다. Southern 분석 결과 국화의 genome 내에서는 복수의 F3'H 유전자를 갖는 것이 확인되었다. $DgF3'H$ 유전자의 발현 정도를 분석한 결과, 연분홍의 'Argus'와 두 개의 보라색 변이체(AM1 and AM3)에서 높게 발현되었으나 흰색 변이체(AM2)에서는 매우 약하게 발현되었으며, 염기서열 변이에 의한 F3'H 유전자의 구조적 차이가 화색의 변이에 관련된 것으로 추정되었다. 국화 'Argus' 및 화색 변이체를 이용하여 본 연구에서 분리한 신규 F3'H 유전자의 구조 및 유전자 발현 등을 포함하는 유전정보들은 화색 변이의 유전적 기작을 밝히는데 중요한 자료로 이용될 것으로 기대되나 향후 다른 유전적 발현요소들이 국화의 F3'H 유전자의 발현에 관여하는지에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 하겠다.

• 생명과학회지
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• 제19권1호
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• pp.101-110
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• 2009

유전자 발현의 조절은 세포주기 조절에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서 새로운 $mas2^+$ (${\underline{m}}itosis$ ${\underline{as}}sociated$ protein) 유전자는 인간의 SMARCAD1와 상동성을 갖고 분열형 효모인 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)에서 gene-specific PCR 방법에 의해서 분리하였다. 분리된 유전자는 SNF2 도메인이 위치해 있고, 이것은 염색체 재구성에 관련되어 있다. $adh1^+$을 이용한 $mas2^+$ 전사체의 발현량 분석은 $mas2^+$의 발현수준은 S. pombe에서 격막 형성 전에 가장 높았다. $mas2^+$ 완전돌연변이의 세포분열은 26와 $35^{\circ}C$에서 지연되는 현상이 보였고, 다수익 다중 격막이나 핵분열이 일어나지 않는 세포들을 발견하였다. 세포들을 완전배지인 YES에서 증식을 증가시키기 위해서 배양했을 때, 정상과 다른 형태의 표현형을 가진 $mas2^+$ 완전돌연변이 세포들이 증가했다. 이런 표현형들은 $mas2^+$ 유전자의 과발현에 의해서 감소하였다. Mas2 단백질은 S. pombe의 핵내에 위치하였다. 이런 결과들은 $mas2^+$가 인간의 SMARCAD1과 상동성을 갖고 있고, 염색체 재구성과 격막 형성 조절에 사용된다는 것을 나타낸다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권2호
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• pp.104-111
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• 1996

감자의 genomic DNA library로 부터 분리한 proteinase inhibitor II (pin2) 유전자들의 제한효소 지도를 작성 하였던바 이미 분리된 상처 유발 (wound-inducible)pin2K 유전자의 것과 상이성이 있는 pin2T를 분리하여 염기서열을 결정하였다. 두 유전자의 염기서열은 전체적으로 약 86%의 동일성을 보였으며 특히 promoter 부위의 염기서열은 pin2K 유전자의 전사개시 부위의 상대적인 위치인 -714까지 네부분의 결손(20 내지 60bp)을 제외하던 약 91%수준의동일성을 보였다. 분리한 유전자들의 promoter 부위를 표지 유전자인 CAT와 GUS 유전자에 연결 시킨후 담배에서의 발현을 추적하였던바, pin2K 유전자의 promoter에 의한 표지유전자의 발현은 상처에 의해 발현 되었으나 pin2T 유전자의 promoter에 의한 표지유전자의 발현은 상처 유무와 관계없이 낮은 수준으로 나타났다. 또한 pin2T 유전자의 Promoter 내의 결손은 핵 단백질의 promoter에의 결합에 영향을 주지 않았으며 상처 유발pin2K 유전자의 promoter 염기서열과 비교하였을때 pin2T 유전자의 promoter 부위내에 5'-AGTAAA-3'라는 특별한 염기부위가 자연적으로 제거된것을 알수 있었다. 또한 5'-AGTAAh-3'의 염기부위가 다른 상처 유발 유전자들에서는 흔히 발견되고, 다른 식물 유전자들의 Promoter에서는 쉽게 발견이 되지 않았다. 따라서 상처 유발 pin2K 유전자의 Promoter내에 상처 유발과 관련있는 특별한 염기부위가 자연적으로 결실되어 pin2T 유전자의 발현이 상처 유발성을 잃은것으로 짐작된다.

• 생명과학회지
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• 제15권3호
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• pp.415-422
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• 2005

Mycobacterium hovis BCG 균주에 transposon을 사용하여 mutagenesis를 수행함으로써 mutant library를 제조하였다. 이 mutant library를 screening하여 항결핵제인 PA-824에 내성을 갖는 mutant들을 얻었고, M. bovis wild type에서는 정상적으로 생성되는 coenzyme $F_{420}$이 대부분의 이들 mutant들에서는 생성되지 않는다는 것을 알게 되었다. 세포 추출액을 HPLC로 분석해본 결과, 그 중에서 한 mutant는 $F_{420}$은 생성하지 않으나 그 전구물질인 F0는 생성하고 있음이 밝혀졌다. 따라서 이 mutant 에서는 $F_{420}$생합성 회로의 마지막 단계가 차단되어있음을 알 수 있다. 이 mutant를 inverse PCR을 통해 분석해본 결과, transposon이 Rv2435c유전자에 삽입되어있는 것을 확인할 수 있었다. Rv2435c유전자는 세포막에 결합되어있는 80.3 kDa의 단백질을 암호화하는 것으로 추정되고, 이 단백질의 N-말단은 periplasm에 존재하고 C-말단은 원형질에 존재하는 것으로 추정되고 있다. 원형질에 존재하는 C-말단은 원핵생물과 진핵생물들의 adenylyl cyclase들과 높은 유사성을 나타낸다. Adenylyl cyclase는 ATP로부터 cAMP를 생합성하는 효소이다 M. tuberculosis나 M. bovis의 genome에는 class III adenylyl cyclase를 암호화하는 것으로 추정되는 유전자가 모두 15개나 존재한다 특히 이들 중에서 Rv1625c 와 Rv2435c는 포유류의 adenylyl cyclase들과 높은 유사성을 가지는 것으로 알려져 있다 이 Rv2435c 단백질이 진정한 adenylyl cyclase인지를 확인하기 위하여 우리는 이 단백질 중에서 원형질에 존재하는 부분을 말단에 6개의 histidine을 첨부한 채로 대장균에서 발현시켰다. 대장균에서 이 단백질이 생성되는 것은 histidine이 첨부된 단백질을 Ni-NTA resin을 사용하여 대장균으로부터 분리함으로써 확인하였다. 그러나 이 단백질이 대장균에서 cya mutation을 complementation하지 못하였고, 따라서 이 단백질이 adenylyl cyclase 활성을 갖지 않음을 알 수 있었다. 자외선이나 hydroxylamine을 사용한 mutagenesis 또는 Rv2435c와 Rv1625c간의 토sion단백질을 만들어서, 이 단백질이 adenylyl cyclae로서의 활성을 획득하도록 하는 모든 시도는 실패하였다. 따라서 Rv2435c단백질이, F0가 $F_{420}$으로 변환되는 데에 영향을 미치는 방법이 cAMP를 생성함으로써가 아니라 다른 방법으로 영향을 미치고 있다는 것을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제21권12호
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• pp.1666-1677
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• 2011

세포주기조절에서 유전자 발현의 조절은 매우 중요한 부분이다. 본 연구에서는 인간의 유전자인 CIP29/Hcc1과 상동성을 가지는 분열형 효모의 새로운 유전자 mas1+을 분리하였다. 중합효소연쇄반응을 수행하여 cDNA를 얻고 이 cDNA의 염기서열을 분석한 결과 mas1+의 전체 염기서열은 735 bp로서, 245개의 아미노산을 암호화하고 있다. mas1+의 프로모터에서는 M-G1에 특이적인 전사를 보이는 유전자들에 보존되어 있는 PCB 서열이 발견되었다. 세포주기별 mas1+의 전사 수준을 분석한 결과 격막이 형성된 세포수의 빈도를 나타내는 격막 세포지표 의 양상과 유사하게 발현하는 것을 확인하였다. mas1+ 결손 돌연변이를 $25^{\circ}C$와 $36^{\circ}C$에서 배양한 결과, 세포질 분열과정이 늦어진 다중격막 세포의 빈도가 증가하였다. 이를 FACS로 분석하여 DNA 함량이 2C, 4C와 6C등이 형성됨을 확인하였다. mas1+결손 돌연변이 세포를 질소 결핍 배양액에서 배양한 결과 다중격막 세포의 형성이 확연히 증가하였는데 이는 질소 결핍에 따른 세포분열의 가속화 단계에서 mas1+의 결손이 특히 부정적 영향을 초래함을 시사한다. mas1+ 유전자 결손 돌연변이 세포에 mas1+을 포함한 plasmid를 형질전환한 후 mas1+의 발현을 유도한 결과 정상의 세포 형태로 전환됨을 확인하였다. Mas1 단백질에 EGFP를 융합시켜 발현을 유도한 결과 핵내에서 위치함을 분열형 효모와 인간 배양세포인 HeLa에서 확인하였다. 또한, mas1+ 결손 돌연변이에서 상동성을 가지는 인간 유전자 CIP29/Hcc1을 발현시킨 결과 multi-septate 세포가 줄어들었다. 한편, 생쥐의 배발달 단계에 따른 CIP29 유전자의 전사체 수준은 세포 분열이 활발한 시기에 증가하였다. 이상의 결과들은 Mas1은 인간의 핵단백질인 유전자 CIP29/Hcc1과 구조 기능적으로 상동성을 가지며, 세포주기 중 M-G1에 속하는 세포질 분열에 연관되어 있음을 시사한다.