The breakdown rate of NAD in Salmonella typhimurium was investigated both in aerobic and anaerobic conditions. After NAD is broken down to nicotinamide ring containing moiety, almost all the nicotinamide ring containing moiety recycles back to NAD pool. However almost none of the adenine containing moiety recycles back. We pulse-label the endogeneous NAD with [$\^$14/C]-adenine and [$\^$3/H]- niacin. The remaining [$\^$14/C]-radioactivity in NAD pool at each time was regarded as unbroken portion of NAD, WHERE AS THE OF [$\^$3/H] was served as a total amount of NAD to start with. Under aerobic condition, the half-life of NAD was around 2 hours. However, the breakdown rate was significantly reduced (around 3-5 fold) under anaerobic condition. The observation that under aerobic conditions, NAD turnover is considerably faster than under anaerobic conditions suggests that oxygen has important effect in NAD breakdown.
In order to produce nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) which is a pyridine nucleotide coenzyme, Saccharomyces sake KBA No. 6 having high NAD content was selected from 12 strains of yeast and various factors affecting the production of NAD were investigated. For NAD production, 4% of glucose was effective as a carbon source and 2% of bactopeptone was the best nitrogen source. The optimum pH and temperature was 5.0 and $30^{\circ}$, respectively. Also, when 4 mg/ml of nicotinamide and 3 mg/ml adenine were used as precursors simultaneously, NAD production was the best. To increase NAD production, 2 valence metal ions were used during cultivation and $Zn^{2+}$ was very efficient. Among the surface active agents, anionic sodium dodesyl sulfate (SDS) was effective. Under the optimum conditions, the maximum amount of produced NhD was 35 mg/100 ml medium after cultivation of 144 hrs and 89% of total NAD amount, 31 mg of NAD, was leaked into culture broth.
NAD+ analogs, 8-( 6-aminohexyl) aminonicotinamide adenine dinucleotide and N6-[(6- aminohewl)-carbamoylmethyl]- NAD+, were imobilized on bovine caseins by the action of hansglutaminase. It appears that NAD+ analogs bind with $\alpha$S1-and $\beta$-caseins through formation of the r-glutamylamine bond between the amino groups attached to the hexyl chains in NAD+ analogs and the glutaminyl residues in caseins. The NAD+ analogs immobilized on the caseins were enzymatically reducible by alcohol dehydrogenase. $\beta$-Casein was more useful carrier than the $\alpha$S1-casein and 8-substituted NAD+ analog was more effective than N6-substituted one in immobilization. Michaelis constant of 8-substituted NAD+ analog immobilized on $\beta$-casein in alcohol dehydrogenase reaction was similar to that of free from of NAD+ and that of NAD+ analog. Immobilized NAD+ was much more stable at alkaline pH than free NAD+ and its analog while maximum velocity was reduced to 31% of the free NAD+ analog. The coenzyme casein conjugated was recovered almost completely in casein precipitated by calcium.
The purpose of this work was to perform the characterization of NAD(P)H-nitroreductase isolated from Stenotrophomonas sp. OK-5 capable of degrading 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). Initially, NADP(H)-nitroreductase by a series of purification processes including ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, andQ-sepharose was prepared. From samples harvested from fraction collector, three different fractions (I, II & III)having the enzyme activity of NAD(P)H-itroreductase were detected. Specific activities of three fractions I, II,and III of NAD(P)H-nitroreductase were determined to approximately 5.06 unit/mg, 4.95 unit/mg and 4.86 unit/mg, and concentrated to 10.5, 9.8, and 8.9-fold compared to crude extract, respectively. Among these three fractions,the fraction I of NAD(P)H-nitroreductase demonstrated the highest specific activity in this experiment. Several factors affecting on the enzyme activity of NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II & III) were investigated.The optimum temperature of all NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II & III) was 30oC, and the optimal pH was approximately 7.5. Metal ions such as Ag+, Cu2+, Hg2+ inhibited approximately 80% enzyme activity of all NAD(P)H-nitroreductase, and the enzyme activities were decreased about 30-40% inhibition in the presence of Mn2+ or Ca2+. However, Fe3+ showed stimulatory effect on the enzyme activity. The molecular weights of NAD(P)H-nitroreductase (fractions I, II & III) were measured about 27 kDa on the SDS-PAGE.
The effect of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) on the intracellular $Ca^{2+}$ level was studied in NIH3T3 fibroblast cells. A reduction of the intracellular $Ca^{2+}$ level was observed after exposure to 300 ${\mu}m$ MNNG. However, the intracellular level of $IP_3$, a well-known regulator of $Ca^{2+}$ release from internal storage, was not changed by MNNG treatment. Instead, a reduction of the intracellular NAD level was observed. NAD as well as $IP_3$ stimulated intracellular $Ca^{2+}$ release from permeabilized cells. The treatment of 3-aminobenzamide, which inhibited the MNNG-induced reduction of the NAD level, also prevented the MNNG-induced decrease of the $Ca^{2+}$ level. Our data suggest that MNNG reduces the intracellular $Ca^{2+}$ level by NAD depletion in NIH3T3 cells.
Oxidoreductases are effective biocatalysts, but their practical use is limited by the need for large quantities of NAD(P)H. In this study, a whole-cell biocatalyst for NAD(P)H cofactor regeneration was developed using the economical substrate glycerol. This cofactor regeneration system employs permeabilized Escherichia coli cells in which the glpD and gldA genes were deleted and the gpsA gene, which encodes $NAD(P)^+-dependent$ glycerol-3-phosphate dehydrogenase, was overexpressed. These manipulations were applied to block a side reaction (i.e., the conversion of glycerol to dihydroxyacetone) and to switch the glpD-encoding enzyme reaction to a gpsA-encoding enzyme reaction that generates both NADH and NADPH. We demonstrated the performance of the cofactor regeneration system using a lactate dehydrogenase reaction as a coupling reaction model. The developed biocatalyst involves an economical substrate, bifunctional regeneration of NAD(P)H, and simple reaction conditions as well as a stable environment for enzymes, and is thus applicable to a variety of oxidoreductase reactions requiring NAD(P)H regeneration.
The NAD(P)H-quinone oxidoreductase (EC 1. 6. 99. 2) was purified from S. cerevisiae. The native molecular weight of the enzyme is approximately 111 kDa and is composed of five identical subunits with molecular weights of 22 kDa each. The optimum pH of the enzyme is pH 6.0 with 1,4-benzoquinone as a substrate. The apparent $k_m$ for 1,4-benzoquinone and 1,4- naphthoquinone are 1.3 mM and $14.3\;{\mu}M$, respectively. Its activity is greatly inhibited by $Cu^{2+}$ and $Hg^{2+}$ ions, nitrofurantoin, dicumarol, and Cibacron blue 3GA. The purified NAD(P)H-quinone oxidoreductase was found capable of reducing aromatic nitroso compounds as well as a variety of quinones, and can utilize either NADH or NADPH as a source of reducing equivalents. The nitroso reductase activity of the purified NAD(P)H-quinone oxidoreductase is strongly inhibited by dicumarol.
Plants have been shown to contains $Ca^{2+}$/calmodulin-stimulated GAD and NAD kinase. To test how calmodulin and calmodulin methylation affect the activation of GAD and NAD kinase, GAD and NAD kinase were partially purified from tobacco plants. GAD was also partially purified from E. coli transformed with a plasmid carrying a cloned tobacco GAD gene. We find that GAD from the transformed E. coli showed 60-fold $Ca^{2+}$/calmodulin-dependent activation. However, GAD from tobacco plants was stimulated only about 3.8-fold by the addition of calmodulin in the presence of calcium, suggesting high background activity of the enzyme was possibly due to bound endogenous tobacco calmodulin. There were no significant differences in the tobacco GAD activator properties between calmodulins. A monoclonal antibody against petunia GAD interacted strongly with both GAD from tobacco plants and GAD from cloned gene. NAD kinase from tobacco plants showed a complete $Ca^{2+}$/calmodulin dependency for activity. Unmethylated calmodulins activated GAD in a manner similar to methylated calmodulin. However, the maximum level of NAD kinase activation obtained with unmethylated calmodulins is approximately 4-fold higher than methylated calmodutins. These data suggested that endogenous tobacco calmodulin may interact more tightly with GAD than NAD kinase and that calmodulin methylation affects the activator properties of calmodulins for tobacco NAD kinase but not for GAD.
An anion-charged membrane was used for selective retention of coenzyme NAD(H) in reactor without any chemical modification. The membrane could reject permeation of NAD (H) (80.9%) but not reject permeation of product. The retention ratio was enhanced in the presence of albumin and Tris-maleate buffer. A bioreactor equipped with a membrane, NTR 7410 was constructed and used in the repeated batch production of sorbitol. NADH-dependent sorbitol dehydrogenase from sheep liver was used for the production of sorbitol from fructose. The coenzyme oxidized was regenerated with alcohol dehydrogenase. 47g/L sorbitol was produced for 198 hr with a substrate conversion ratio of 70%. The retention ratio was almost maintained throughout the entire reaction.
Environmentally-friendly acrylic resin particles having the diameter between $0.1\;and\;1\;{\mu}m$ were prepared using non-aqueous dispersion (NAD) polymerization technique. The first step is to prepare the stabilizer and the next step is the NAD polymerization by dropping an acrylic monomer to stabilizer dispersed in organic media. To obtain a NAD resin with proper level of viscosity, it fumed out that stabilizers having sufficient viscosity such as 1000 cP need to be used, for which the stepwise feeding of monomer and initiator was necessary. It was necessary to put proper amount of stabilizer, but no more increase in viscosity was observed when more than that amount of stabilizer was added. Choice of proper monomers considering solubility parameter was essential to avoid the bimodal particle size distribution in the NAD resin product.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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