• 제목/요약/키워드: molecular monitoring

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Development of Molecular Diagnosis Using Multiplex Real-Time PCR and T4 Phage Internal Control to Simultaneously Detect Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, and Cyclospora cayetanensis from Human Stool Samples

  • Shin, Ji-Hun;Lee, Sang-Eun;Kim, Tong Soo;Ma, Da-Won;Cho, Shin-Hyeong;Chai, Jong-Yil;Shin, Eun-Hee
    • Parasites, Hosts and Diseases
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    • 제56권5호
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    • pp.419-427
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    • 2018
  • This study aimed to develop a new multiplex real-time PCR detection method for 3 species of waterborne protozoan parasites (Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, and Cyclospora cayetanensis) identified as major causes of traveler's diarrhea. Three target genes were specifically and simultaneously detected by the TaqMan probe method for multiple parasitic infection cases, including Cryptosporidium oocyst wall protein for C. parvum, glutamate dehydrogenase for G. lamblia, and internal transcribed spacer 1 for C. cayetanensis. Gene product 21 for bacteriophage T4 was used as an internal control DNA target for monitoring human stool DNA amplification. TaqMan probes were prepared using 4 fluorescent dyes, $FAM^{TM}$, $HEX^{TM}$, $Cy5^{TM}$, and CAL Fluor $Red^{(R)}$ 610 on C. parvum, G. lamblia, C. cayetanensis, and bacteriophage T4, respectively. We developed a novel primer-probe set for each parasite, a primer-probe cocktail (a mixture of primers and probes for the parasites and the internal control) for multiplex real-time PCR analysis, and a protocol for this detection method. Multiplex real-time PCR with the primer-probe cocktail successfully and specifically detected the target genes of C. parvum, G. lamblia, and C. cayetanensis in the mixed spiked human stool sample. The limit of detection for our assay was $2{\times}10$ copies for C. parvum and for C. cayetanensis, while it was $2{\times}10^3$ copies for G. lamblia. We propose that the multiplex real-time PCR detection method developed here is a useful method for simultaneously diagnosing the most common causative protozoa in traveler's diarrhea.

폭약 TNT를 분해하는 세균인 Pseudomonas SP. HK-6에서 분리정제된 Nitroreductase의 특성연구 (Characterization of Nitroreductase Purified from TNT-degrading Bacterium, Pseudomonas sp. HK-6.)

  • 호은미;강형일;오계헌
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제32권3호
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    • pp.230-237
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    • 2004
  • 균주 Pseudomonas sp. HK-6로부터 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)의 대사 과정에서 유도되는 nitroreductase (NTR)를 분리 및 정제하여 다양한 특성조사를 실시하였다. NTR은 균주 HK-6의 세포추출물로부터 ammonium sulfate 침전, DEAE-sepharose, 그리고 Q-sepharose chromatography의 일련의 과정을 통하여 분리되었고, NTR의 활성을 가지는 세개의 다른 fractions를 확인하였다. 균주 HK-6의 NTR fractions I, II, 그리고 III의 비 활성은 각각 4.85 unit/mg, 5.47 unit/mg, 5.01 unit/mg으로 측정되었으며, 세포추출물에 비해 각각 9.0배, 10.1배, 9.3배 농축된 것으로 나타났다. SDS-PAGE에서 측정된 균주 HK-6의 NTR fractions I, II 그리고 III의 분자량은 모두 약 27 kDa으로 확인되었다. 정제된 NTR의 활성에 온도, pH, 금속 이온, 억제 물질의 효과와 기질 특이성 등에 대한 물리화학적 특성 조사를 실시하였다. 균주 HK-6의 NTR fractions I, II, 그리고 III의 적정온도는 $25~35^{\circ}C$ 확인되었고, 모두 $30^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며, 이들 효소 활성의 적정 pH는 7.0~8.0이었고, 최적 pH는 7.5로 확인되었다. TNT에 대한 HK-6의 NTR fractions I, II, 그리고 III의 활성은 금속 이온 $Ag^{+}$ , $Cu^{2+}$ , 그리고 $Hg^{V}$ 에 의해서 약 70%이상 저해되었으며, $Mn^{2+}$ 또는 $Ca^{2+}$ 에 의해서 약 20~50%로 활성이 억제되었다. 그러나 $Fe^{2+}$ /첨가 시에는 효소의 활성에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. NTR의 활성에 대한 억제물질의 영향은 $\beta$-mercaptoethanol 첨가 시에 효소의 활성이 모두 억제되었고, dithiothreitol, EDTA, 그리고 NaCl 첨가시에도 활성이 감소하는 것으로 확인되었다. TNT와 그 유사기질을 이용하여 HK-6에서 분리된 NTR의 기질 특이성을 조사한 결과, TNT, nitrobenzene, 그리고 RDX에 대해서는 비교적 활성이 높게 나타났으나 2,6-DNT와 2,4-DNT에서는 낮은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

도시 내 육상 생물종 모니터링을 위한 환경DNA 리뷰 및 적용 (Review and application of environmental DNA (eDNA) investigation of terrestrial species in urban ecosystem)

  • 김휘문;김성열;박일수;이현정;김경태;김영;김혜정;곽민호;임태양;박찬;송원경
    • 한국환경복원기술학회지
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    • 제23권2호
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    • pp.69-89
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    • 2020
  • Scientific trust and quantification of traditional species investigation and results that have been used in ecology for decades has always been a problem and concern for ecologists. Global ecologists have proposed DNA-based species investigation studies to find answers to problems. In this study, we reviewed the global trend of research on environmental DNA(eDNA), which is a method for monitoring species by detecting DNA of organisms naturally mixed in environmental samples such as water, soil, and feces. The first eDNA research confirmed the possibility of species investigation at the molecular level, and commercialization of NGS(Next Generation Sequencing) and DNA metabarcoding elicits efficient and quantitative species investigation results, and eDNA research is increasing in the filed of ecology. In this study, mammals and birds were detected using MiMammal universal primers from 23 samples(3 natural reserves; 20 water bowls) out of 4 patches to verify eDNA for urban ecosystems in Suwon, and eDNA was verified by performing camera trapping and field survey. Most terrestrial species were detected through eDNA, and particularly, mice(Mus musculus), and Vinous-throated Parrotbill (Sinosuthora webbiana) were identified only with eDNA, It has been confirmed to be highly effective by investigating techniques for small and internal species. However, due to the lack of resolution of the primer, weasels(Mustela sibirica) and squirrels(Melanochromis auratus) were not detected, and it was confirmed that the traditional investigation method was effective only for a few species, such as Mogera robusta(Mogera robusta). Therefore, it is judged that the effects of species investigation can be maximized only when eDNA is combined with traditional field survey and Camera trapping to complement each other.

Monitoring of Chicken RNA Integrity as a Function of Prolonged Postmortem Duration

  • Malila, Yuwares;Srimarut, Yanee;U-chupaj, Juthawut;Strasburg, Gale;Visessanguan, Wonnop
    • Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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    • 제28권11호
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    • pp.1649-1656
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    • 2015
  • Gene expression profiling has offered new insights into postmortem molecular changes associated with meat quality. To acquire reliable transcript quantification, high quality RNA is required. The objective of this study was to analyze integrity of RNA isolated from chicken skeletal muscle (pectoralis major) and its capability of serving as the template in quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) as a function of postmortem intervals representing the end-points of evisceration, carcass chilling and aging stages in chicken abattoirs. Chicken breast muscle was dissected from the carcasses (n = 6) immediately after evisceration, and one-third of each sample was instantly snap-frozen and labeled as 20 min postmortem. The remaining muscle was stored on ice until the next rounds of sample collection (1.5 h and 6 h postmortem). The delayed postmortem duration did not significantly affect $A_{260}/A_{280}$ and $A_{260}/A_{230}$ ($p{\geq}0.05$), suggesting no altered purity of total RNA. Apart from a slight decrease in the 28s:18s ribosomal RNA ratio in 1.5 h samples (p<0.05), the value was not statistically different between 20 min and 6 h samples ($p{\geq}0.05$), indicating intact total RNA up to 6 h. Abundance of reference genes encoding beta-actin (ACTB), glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT), peptidylprolylisomerase A (PPIA) and TATA box-binding protein (TBP) as well as meat-quality associated genes (insulin-like growth factor 1 (IGF1), pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4 (PDK4), and peroxisome proliferator-activated receptor delta (PPARD) were investigated using qPCR. Transcript abundances of ACTB, GAPDH, HPRT, and PPIA were significantly different among all postmortem time points (p<0.05). Transcript levels of PDK4 and PPARD were significantly reduced in the 6 h samples (p<0.05). The findings suggest an adverse effect of a prolonged postmortem duration on reliability of transcript quantification in chicken skeletal muscle. For the best RNA quality, chicken skeletal muscle should be immediately collected after evisceration or within 20 min postmortem, and rapidly preserved by deep freezing.

Survey of genetic structure of geese using novel microsatellite markers

  • Lai, Fang-Yu;Tu, Po-An;Ding, Shih-Torng;Lin, Min-Jung;Chang, Shen-Chang;Lin, En-Chung;Lo, Ling-Ling;Wang, Pei-Hwa
    • Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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    • 제31권2호
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    • pp.167-179
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    • 2018
  • Objective: The aim of this study was to create a set of microsatellite markers with high polymorphism for the genetic monitoring and genetic structure analysis of local goose populations. Methods: Novel microsatellite markers were isolated from the genomic DNA of white Roman geese using short tandem repeated probes. The DNA segments, including short tandem repeats, were tested for their variability among four populations of geese from the Changhua Animal Propagation Station (CAPS). The selected microsatellite markers could then be used to monitor genetic variability and study the genetic structures of geese from local geese farms. Results: 14 novel microsatellite loci were isolated. In addition to seven known loci, two multiplex sets were constructed for the detection of genetic variations in geese populations. The average of allele number, the effective number of alleles, the observed heterozygosity, the expected heterozygosity, and the polymorphism information content were 11.09, 5.145, 0.499, 0.745, and 0.705, respectively. The results of analysis of molecular variance and principal component analysis indicated a contracting white Roman cluster and a spreading Chinese cluster. In white Roman populations, the CAPS populations were depleted to roughly two clusters when K was set equal to 6 in the Bayesian cluster analysis. The founders of private farm populations had a similar genetic structure. Among the Chinese geese populations, the CAPS populations and private populations represented different clads of the phylogenetic tree and individuals from the private populations had uneven genetic characteristics according to various analyses. Conclusion: Based on this study's analyses, we suggest that the CAPS should institute a proper breeding strategy for white Roman geese to avoid further clustering. In addition, for preservation and stable quality, the Chinese geese in the CAPS and the aforementioned proper breeding scheme should be introduced to geese breeders.

제주도 개가시나무의 유전구조와 유전적 다양성 (Genetic Diversity of Quercus gilva in Je-ju Island)

  • 김고운;장경수;임형우;김은혜;이계한
    • 한국산림과학회지
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    • 제107권2호
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    • pp.151-157
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    • 2018
  • 본 연구는 제주도에 생육하고 있는 개가시나무(Quercus gilva Blume)에 대한 유전적 다양성을 분석하여 보전전략을 수립하기 위한 기초데이터 마련을 목적으로 하였다. 제주도 내 5집단 80개체를 대상으로 ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) 분석을 시행하였다. 총 6개의 ISSR 프라이머를 이용하여 72개의 증폭산물을 관찰하였으며 그 중 67개의 증폭산물이 다형성이 있는 것으로 나타났다. 집단 수준에서의 다형적 유전자좌의 비율은 93%로 나타났으며, S.I. (Shannon's information index)=0.237, h (Nei's genetic diversity)=0.156로 나타났다. AMOVA 분석 결과 $F_{st}$는 0.169의 값을 보여 집단 간 분화가 큼을 나타냈다. 전체 유전변이의 17%가 집단 간 차이, 나머지 83%는 집단 내 개체 간에 존재하는 것으로 보여 집단 간의 변이보다 집단 내 변이가 더 큰 것으로 나타났다. 이와 같은 연구결과를 바탕으로 개가시나무 서식지의 산림유전자원보호구역 지정 및 지속적인 모니터링, 생육환경의 개선을 통한 치수의 생장력 강화, 현지 외 유전자원 보전 및 현지 외 개체군과의 환경적 유전적 차이 비교를 통한 보전방안을 마련해야할 필요성이 있을 것으로 사료된다.

사천시 용정천에서 하천 생태계와 하안단구 지역의 수변식물상 (River Ecosystem and Floristic Characterization of Riparian Zones at the Youngjeong River, Sacheon-ci, Korea)

  • 허만규
    • 생명과학회지
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    • 제27권3호
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    • pp.301-309
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    • 2017
  • 본 연구는 경상남도 사천시 용정천에서 하천의 건강도와 식생 구조를 평가하기 위해 하천의 상, 주, 하류에서 물리적 구조와 30곳의 방형구에서 식물 피도를 조사하였다. 2015년 이 하천의 전체 수변식물상은 28과 72속 75종 13변종이었다. 상류 제방의 식생은 초본, 관목, 교목의 혼합 군락이었다. 상류지역의 하안단구 식생은 자연 침식으로 형성된 식물상이었다. 상류에서는 40종의 식물이 동정되었고 우점 군락은 교목이었다. 중류 지역에서 홍수터는 자연식생과 인공식생이 혼재하였다. 제외지는 초지가 우세하였다. 상, 중, 하류의 피도-풍부도(cover-abundance)는 각각 9.26, 7.24, 7.56이었다. 잎이 좁은 초본과 잎이 넓은 광엽 초본의 피도-풍부도는 유사한 비율을 나타내었다. 최근 이 지역의 하첨 주변은 상업 및 산업 시설이 설치되어 제외지 등에서 많은 하천변 식생이 훼손되었다. 따라서 이 하천의 지속 가능한 유지를 위해서는 생물종 다양성에 대한 모니터링이 필요하다고 사료된다.

2015년부터 2018년까지 일개 이차병원에서 동정된 소아 급성 위장염 원인 병원체의 분자진단과 역학의 임상적 연구 (Molecular Detection and Epidemiology of Etiologic Agents among Children with Acute Gastroenteritis at a Secondary Hospital from 2015 to 2018)

  • 김영상;정주영
    • Pediatric Infection and Vaccine
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    • 제27권2호
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    • pp.90-101
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    • 2020
  • 목적: 급성 위장염의 대부분의 경우 원인 병원체가 확인되지 않는다. 최근 들어 발달한 multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) 검사는 장염 병원체 검출에 도움을 줄 수 있다. 이 연구는 multiplex RT-PCR을 이용해, 소아 장염환자에서 병원체의 역학을 조사하고자 하였다. 방법: 2015년 5월부터 2018년 6월까지 대한민국 서울의 2차병원에서 급성 위장염으로 진단받은 소아 환자의 대변에서 병원체를 확인하기 위해 multiplex RT-PCR 검사를 시행하였다. 결과: 바이러스 병원체에 대한 1,366개의 대변 검체 중, 483개(35.3%)에서 1개 이상의 병원체가 분리되었다. A군 로타바이러스는 106건(7.8%)에서 확인되었으며, 양성률은 3.0% (8/263)에서 16.7% (48/288)까지 매년 증가했다(P<0.001). 노로바이러스 GII는 가장 흔한 바이러스성 병원체였고(263/1366, 19.3%), 3년간 양성률은 증가하지 않았다. 세균성 병원체에 대한 304개의 대변 검체 중 캄필로박터(32/304, 10.5%)는 가장 흔한 세균성 병원체였으며, 그 다음으로 Clostridium difficile (toxin B) (22/304, 7.2%), 살모넬라균(17/304, 5.6%)이었다. 이 균들의 양성률은 연구기간 동안 증가하지 않았다. 결론: 로타바이러스 백신 도입 이후 노로바이러스 GII가 소아 장염에서 주요한 병원체였지만, 연구기간 동안 로타바이러스 감염 환자가 증가했고, 특히 2018년에는 급증했다. 따라서 새로운 로타바이러스 균주의 등장 가능성을 포함한 추가 연구가 필요하다. 캄필로박터는 소아 세균성 장염의 주요 원인이며, 적절한 치료를 위해 이 균의 임상적 특성을 고려하고 지속적 감시가 필요하겠다.

다중영상기기의 응용 소프트웨어 (Multimodality and Application Software)

  • 임기천
    • Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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    • 제42권2호
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    • pp.153-163
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    • 2008
  • 다중영상기기는 1990년대 초에 처음 개발되어 현재 주요 영상 장비 회사에서 상품으로 개발되어 판매되고 있다. 단순한 소프트웨어적인 정합과 융합을 통해 해부학적 영상과 기능적 영상의 상호 보완하는 단계에서 발전하여 하드웨어적으로 정합하는 하드웨어의 개발은 새로운 연구의 시작이다. 다중영상기기의 발전 이전에는 해부학적 구조를 보여주는 영상 장비와 기능적 영상을 표현하는 장비가 각각 고 분해능과 고 해상도로 많은 발전을 이루어 왔다. 현재는 각 영상 장비의 특징을 살려 효과적으로 결합시킨 다중영상기기의 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 다중영상기기는 단순하게 두 장비를 결합시키는 개념에서 기능적 영상에서 필요한 감쇠 보정을 하면서 동시에 해부학적 위치를 융합 영상 형태로 표현하는 새로운 영상 장비로 발전하고 있다 다중영상기기의 특징을 살릴 수 있는 프로토콜이 개발되고 하드웨어적으로도 상호 보완적으로 결합되고 있다. 실제로 PET/CT와 같은 다중영상기기는 임상적으로 중요한 역할을 하고 있으며 PET 영상기기를 대체하고 있다. PET/CT 스캐너는 PET에서 나오는 기능적 영상과 CT에서 나오는 해부학적 영상뿐만 아니라 융합 영상을 함께 보여 주므로 임상적으로 유용한 정보를 제공하고 있다. 현재 SPECT/CT는 아직 보급이 많이 되지 않았으나 PET/CT와 같이 임상적으로 유용한 SPECT와 CT 장비가 결합된 상품들이 나오고 있어 그 시장이 점점 성장할 것으로 기대된다. 다중영상기기는 각각의 단독 영상장비에서 갖고 있는 문제뿐만 아니라 두 영상 장비를 결합시키므로 인해 새로운 문제들이 발생하고 있다. 대표적으로 호흡에 의한 움직임, 조영제의 영향, 금속 물질의 영향과 환자의 피폭에 관한 문제가 있다. 이를 해결하기 위해 새로운 프로토콜과 프로세싱 방법이 개발되고 있다. 뇌를 동시에 촬영할 수 있는 PET/MR의 개발은 뇌 과학에 많은 발전을 줄 것으로 기대된다. PET/MR의 개발은 PET/CT 에서 촬영한 영상의 일부분을 대체할 것으로 예상된다. MR 영상이 CT 영상보다 우수한 분해능을 보이는 분야에서는 PET/MR을 이용한 검사와 연구가 활발하게 진행될 것으로 보인다. 해부학적 영상과 기능적 영상을 결합시킨 융합 영상을 함께 제공하는 다중영상기기는 환자의 질병을 진단뿐만 아니라 치료 후의 효과를 보는데 있어서 중요한 역할을 할 것으로 기대된다. 또 앞으로 검사 목적에 맞는 다양한 다중영상기기의 개발이 이루어질 것으로 기대된다.

ISSR 분석으로 살펴본 애기등의 유전적 다양성 (Genetic diversity of Millettia japonica in Korea as revealed by ISSR analysis)

  • 김나래;김용인;이정훈;김영동
    • 식물분류학회지
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    • 제43권4호
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    • pp.267-273
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    • 2013
  • 최근 환경부 멸종위기종 급에서 해제된 애기등(Millettia japonica) 집단의 유전적 다양성 분석을 위해 10개 집단(한국 9집단, 일본 1집단) 189개체에 대한 ISSR (Inter-Simple-Sequence-Repeat) 분석을 수행하였다. 조사된 애기등의 유전적 다양성은 같은 과내의 멸종위기종보다 더 높은 것으로 조사되었다(Shannon's information index: I = 0.2689). 집단별 유전적 다양성은 전북 고창(I = 0.2968) 집단과 경남 남해(I = 0.2951), 경북 토함산(I = 0.2823) 집단이 높았으며, 일본 큐슈(I = 0.2487) 집단이 가장 낮았다. 애기등 10개 집단이 공유하는 유전변이의 양은 전체 유전변이의 86.49%로 나타났고, 전체의 13.51%가 집단간 유전적 차이에 의한 것으로 나타났다. 또한 조사된 애기등 집단간 교류를 나타내는 Nm 값(1.8446)이 비교적 높은 것으로 나타났으며, 이에 따라 집단간 유전적 분화가 크게 일어나지 않았음을 알 수 있었다. 본 연구 결과 애기등의 유전자원 보존을 위해서는 유전다양도가 높은 집단을 중심으로 지속적인 자생지 모니터링이 요구되며, 현지외 보존을 위해서는 더 높은 유전적 다양도를 지닌 전북 고창, 경남 남해, 경북 토함산 집단에서 다수 개체를 선발하는 보존 전략이 적절할 것으로 판단된다.