This study characterizes the growth of white rot fungi Phanerochaete chrysosporium IFO 31249) and lignin peroxidase(LiP) activity in different submerged culture media. P. chrysosporium was grown in the form of pellet of various sizes from a spore inoculum under shaking liquid culture condition. While the growth of mycelia was higher under the nitrogen-sufficient culture than under the nitrogen-limited culture, ligninase activity was relatively lower. The lignin peroxidase appeared in nitrogen-limited culture and was suppressed by excess nitrogen. High level(40U/l) of lignin peroxidase activity was obtained in the growth medium containing 1.5mM veratryl alcohol, a secondary metabolite of P. chrysosporium. Lignin peroxidase production was not observed under conditions of nitrogen sufficiency or in balanced media, suggesting that control parameters could increase the activity by manipulating the secondary metabolism.
리그닌 분해에 관련된 효소 중 laccase는 구리 결합부위가, lignin peroxidase와 manganese peroxidase는 헴(heme) 결합부위의 아미노산 서열이 잘 보존된 단백질들이다. 국내에서 분리한 구름버섯(Trametes versicolor)을 대상으로 관련 유전자들의 보존된 지역의 염기서열을 근거로 중합연쇄반응(PCR)에 필요한 primer를 제작하였고, 이를 사용하여 해당 유전자의 조각을 확보하였다. 이를 pGEM-T vector에 cloning하고 그 염기서열을 분석한 결과 약 1.3 kb의 laccase조각은 다른 백색부후균의 laccase와 65~97%의 상동성을 보였다. 또한 185 bp의 lignin peroxidase 조각과 443 bp의 manganese peroxidase조각을 타 백색부후균의 효소들과 비교한 결과 각각 80~95% 및 61~83%의 상동성을 보였다.
Since biosynthesis of lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium was known to be sensitive to shear, it is interesting to understand the effects of the shear sensitivity for the overproduction of lignin peroxidase. In stirred-tank fermentor, the shear-sensitivity in lignin peroxidase biosynthesis was quantified by using Kolmogorov length scale. It was found that agitation at 80$\mu$m Kolmogorov length scale is advantageous for the production of lignin peroxidase from P. chrysosporium. To overcome the shear sensitivity in lignin peroxidase biosynthesis caused by the agitation,P. chrysosporium was immobilized on various solid carriers. The nylon-immobilized P. chrysosporium was chosen in the present study as a way to overcome the shear sensitivity at the ranges of above 50$\mu$m Kolmogorov length scale. The adhesion force between immobilized cell and carrier can be predicted by thermodynamic approach and used as a criteria to select an adequate carrier materials for immobilization.
Pigment red 53:1 is a dye used in various products as a component of the inks, suspected of being carcinogenic. Thus, the environmental and occupational issues related to it are important. The enzyme-based approach with reusability has advantages to consume less energy and generate less harsh side- products compared to the conventional strategies including separations, microbe, and electrochemical treatment. The degradation of Pigment red 53:1 by the lignin peroxidase immobilized on the surface of magnetic particles has been studied. The immobilization of the peroxidase was conducted on magnetic particle surface with the treatment of polyethyleneimine, glutaraldehyde, and the peroxidase, in sequence. The immobilization was confirmed using X-ray photon spectroscopy. The absorbance peak of the pigment was monitored at 495 nm of UV/Vis spectrum with respect to time to calculate the catalytic activities of the pigment for the immobilized lignin peroxidase. For the comparison, the absorbance of the lignin peroxidase free in solution was also monitored. The catalytic rate constant values for the free lignin peroxidases and the immobilized those were 0.51 and $0.34min^{-1}$, respectively. The reusable activity for the immobilized lignin peroxidase was kept to 92% after 10 cycles. The stabilities for heat and storage were also investigated for both cases.
본 연구의 목적은 회전생물반응기에 고정화한 P. chrysosporium IFO 31249를 이용하여 LiP 생산의 최적 조건을 조사하는 것이다. 회전생물반응기에서 batch culture시 최대 LiP 활성도는 300 U/L이었다. LiP 생산의 최적 조건은 드림의 회전 속도는 1 rpm, 담체 충진율은 20%이었다. MnP 생산을 위한 $MnSO_4$$\cdot$$H_2O$ 의 최적 농도는 50 ppm이었다. 그리고 산소의 충분한 공급은 LiP 생산의 가장 중요한 인자이었다. 또한 LiP 및 MnP의 생산에 있어 repeated-batch culture가 3번이나 가능하였다.
Kraft Lignin which is produced abundantly in pulp industry, was chemically degraded into small oligomers and polymerized using horseradish peroxidase. Lignin acidolysis was optimized by controlling reaction time and HCI concentration. Acidolyzed lignin was polymerized and copolymers of acidolyzed lignin and phenol or p-cresol were synthesized. 70% of kraft lignin was degraded after acidolysis. Number average molecular weight of all lignin polymers were from 8,500 to 14,000 and did not show large difference. Differential scanning calorimeter analysis showed that acidolyzed lignin did not show any melting temparature under $300^{\circ}C$, which indicates that newly synthesized lignin polymers can be used in industry under mild condition.
Experiments for lignin peroxidase production have been conducted by aerobic fermentation of Phanerochaete chrysosporium under low shear rate and enriched oxygen environment. The result of flask cultures of white rot fungus indicated that high oxygen concentration and low shear force were essential for enhancement of lignin peroxidase production. Pentachlorophenol was readily degraded by lignin peroxidase produced in nutrient limited flask cultures. Polyurethane foam was fond to be an effective immobilization matrix of P. chrysosporium.
Veratryl alcohol which has been reported as an inducer for lignin peroxidase showed different effects on the enzyme biosynthesis in Phanerochaete chrysosporium depending on the addition time. Enzyme expression was optimally induced by adding veratryl alcohol when the carbon source began to be depleted. Hydrogen peroxide, to some extent, stimulated production of lignin peroxidase, but beyond a certain concentration, inactivated lignin peroxidase. Tween 80 induced the formation of small pellets, which were resistant to the deactivation by shear stress. Lignin peroxidase production was increased twice compared with that of the control by adopting all the optimal factors in the culture system.
A visual method for the selective screen Eng of lignin degrading enzymes, produced by white rot fungi (WRF), was investigated by the addition of coloring additives to solid media. Of the additives used in the enzyme production media, guaiacol and RBBR could be used for the detection of lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) and lactase. Syringaldazine and Acid Red 264 were able for the detection of both the MnP and lactase, and the LiP and laccase, respectively, and a combination of these two additives was able to detect each of the ligninases produced by the WRF on solid media.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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