• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권3호
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• pp.542-549
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• 2010

In the present study, overexpression, purification, and characterization of Aeropyrum pernix K1 chaperonin B in E. coli were investigated. The chaperonin $\beta$-subunit gene (ApCpnB, 1,665 bp ORF) from the hyperthermophilic archaeon A. pernix K1 was amplified by PCR and subcloned into vector pET21a. The constructed pET21a-ApCpnB (6.9 kb) was transformed into E. coli BL21 Codonplus (DE3). The transformant cell successfully expressed ApCpnB, and the expression of ApCpnB (61.2 kDa) was identified through analysis of the fractions by SDS-PAGE (14% gel). The recombinant ApCpnB was purified to higher than 94% by using heat-shock treatment at $90^{\circ}C$ for 20 min and fast protein liquid chromatography on a HiTrap Q column step. The purified ApCpnB showed ATPase activity and its activity was dependent on temperature. In the presence of ATP, ApCpnB effectively protected citrate synthase (CS) and alcohol dehydrogenase (ADH) from thermal aggregation and inactivation at $43^{\circ}$ and $50^{\circ}$, respectively. Specifically, the activity of malate dehydrogenase (MDH) at $85^{\circ}$ was greatly stabilized by the addition of ApCpnB and ATP. Coexpression of pro-carboxypeptidase B (pro-CPB) and ApCpnB in E. coli BL21 Codonplus (DE3) had a marked effect on the yield of pro-CPB as a soluble and active form, speculating that ApCpnB facilitates the correct folding of pro-CPB. These results suggest that ApCpnB has both foldase and holdase activities and can be used as a powerful molecular machinery for the production of recombinant proteins as soluble and active forms in E. coli.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제56권3호
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• pp.237-245
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• 2018

Toxoplasma gondii can infect all the vertebrates including human, and leads to serious toxoplasmosis and considerable veterinary problems. T. gondii heat shock protein 60 (HSP60) is associated with the activation of antigen presenting cells by inducing initial immune responses and releasing inflammatory cytokines. It might be a potential DNA vaccine candidate for this parasite. A pVAX-HSP60 DNA vaccine was constructed and immune responses was evaluated in Kunming mice in this study. Our data indicated that the innate and adaptive immune responses was elicited by successive immunizations with pVAX-HSP60 DNA, showing apparent increases of CD3e+CD4+ and CD3e+CD8a+ T cells in spleen tissues of the HSP60 DNA-immunized mice ($24.70{\pm}1.23%$ and $10.90{\pm}0.89%$, P<0.05) and higher levels of specific antibodies in sera. Furthermore, the survival period of the immunized mice ($10.53{\pm}4.78day$) were significantly prolonged during the acute T. gondii infection. Decrease of brain cysts was significant in the experimental group during the chronic infection (P<0.01). Taken together, TgHSP60 DNA can be as a vaccine candidate to prevent the acute and chronic T. gondii infections.

• Mass Spectrometry Letters
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• 제9권1호
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• pp.24-29
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• 2018

DC23, a triazolothione resorcinol analogue, is known to inhibit heat shock protein 90 and pyruvate dehydrogenase kinase which are up-regulated in cancer and diabetes, respectively. This study was performed to elucidate the metabolism of DC23 in human liver microsomes (HLMs). HLMs incubated with DC23 in the presence of uridine 5'-diphosphoglucuronic acid (UDPGA) and/or ${\beta}$-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) resulted in the formation of four metabolites, M1-M4. M1 was identified as DC23-N-Oxide, on the basis of LC-MS/MS analysis. DC23 was further metabolized to its glucuronide conjugates (M2, M3, and M4). In vitro metabolic stability studies conducted with DC23 in HLMs revealed significant glucuronide conjugation with a $t_{1/2}$ value of 1.3 min. The inhibitory potency of DC23 on five human cytochrome P450s was also investigated in HLMs. In these experiments, DC23 inhibited CYP2C9-mediated tolbutamide hydroxylase activity with an $IC_{50}$ value of $8.7{\mu}M$, which could have implications for drug interactions.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제29권1호
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• pp.44-54
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• 2019

Geldanamycin and its derivatives, inhibitors of heat shock protein 90, are considered potent anticancer drugs, although their biosynthetic pathways have not yet been fully elucidated. The key step of conversion of 4,5-dihydrogeldanamycin to geldanamycin was expected to catalyze by a P450 monooxygenase, Gel16. The adequate bioconversions by cytochrome P450 mostly rely upon its interaction with redox partners. Several ferredoxin and ferredoxin reductases are available in the genome of certain organisms, but only a few suitable partners can operate in full efficiency. In this study, we have expressed cytochrome P450 gel16 in Escherichia coli and performed an in vitro assay using 4,5-dihydrogeldanamycin as a substrate. We demonstrated that the in silico method can be applicable for the efficient mining of convenient endogenous redox partners (9 ferredoxins and 6 ferredoxin reductases) against CYP Gel16 from Streptomyces hygroscopicus. The distances for ligand FDX4-FDR6 were found to be $9.384{\AA}$. Similarly, the binding energy between Gel16-FDX4 and FDX4-FDR6 were -611.88 kcal/mol and -834.48 kcal/mol, respectively, suggesting the lowest distance and binding energy rather than other redox partners. These findings suggest that the best redox partners of Gel16 could be NADPH ${\rightarrow}$ FDR6 ${\rightarrow}$ FDX4 ${\rightarrow}$ Gel16.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.112-112
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• 2002

Under normal conditions, women produce a single dominant follicle that participates in a single ovuation each menstrual cycle. But Polycystic ovary syndrome(PCOS) conditions, folliculogenesis does not proceed normally. This condition leads to the accumlation of large numbers of small graffian follicles in which the theca interstitial cells (TIC) produce abnormally large amounts of androgen. PCOS is probably the most common endocrine disorder, affecting women of reprodutive age with 5-10% prevalence estimate. Chronic anovulation, hyperandrogenism, hirsutism, obesity, infertility and polycystic ovaries are clinical hallmarks of women with PCOS. Its etiology remains unknown. To investigate the gene expression pattern of ovary in PCO-induced rat, we used cDNA expression analysis. Total RNA was extracted from the ovary of PCO-induced rat and reverse-transcribed in the presence of［$\alpha$$^{32}$P］-dATP Which were hybridized to Atlas$^{TM}$ Rat Toxicology 1.2 array (Clontech) representing approximately 1176 rat genes. We compared gene expression between ovary of pco-induced immature female rats and control. Differential gene expression profiles were revealed (LIFR-alpha, ADRA1A, Heat shock 90-kDa protein A, PDGFRA). Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to validate the relative expression pattern obtained by the cDNA array. The precise relationship between the altered expression of genes and PCO is a matter of further investigation. This study was supported by Korea Science and Engineering Foundation(KOSEF)

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제35권1호
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• pp.33-45
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• 2011

Heat shock protein 90 (Hsp90) is ATPase-directed molecular chaperon and affects survival of cancer cell. Inhibitory effect of Hsp90 by inducing cell cycle arrest and apoptosis in the cancer cell was reported. However, its role during oocyte maturation and early embryo development is very insufficient. In this study, we traced the effects of Hsp90 inhibitor, 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG), on meiotic maturation and early embryonic development in pigs. We also investigated several indicators of developmental potential, including structural integrity, gene expression (Hsp90-, cell cycle-, and apoptosis-related genes), and apoptosis, which are affected by 17-AAG. Then, we examined the roles of Hsp90 inhibitor on viability of primary cells in pigs. Porcine oocytes were cultured in the NCSU-23 medium with or without 17-AAG for 44 h. The proportion of GV arrested oocytes was significantly different between the 17-AAG treated and untreated group (78.2 vs 34.8%, p<0.05). After completion of meiotic maturation, the proportion of MII oocytes was lower in the 17-AAG treated group than in the control group (27.9 vs 71.0%, p<0.05). After IVF, the percentage of penetrated oocytes was significantly lower in the 17-AAG treated group (25.2%), resulting in lower normal pronucleus formation (2PN of 14.6%). Therefore, the inhibition of meiotic progression by Hsp90 inhibitor played a critical role in fertilization status. Porcine embryo were cultured in the PZM-3 medium with or without 17-AAG for 6 days. In result, significant differences in developmental potential were detected between the embryos that were cultured with or without 17-AAG. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) showed that the number of containing fragmented DNA at the blastocyst stage increased in the 17-AAG treated group compared with control (7.5 vs 4.4, respectively). Blastocysts that developed in the 17-AAG treated group had low structural integrity and high apoptotic nuclei than those of the untreated control, resulting in decrease the embryonic qualities of preimplantation porcine blastocysts. The mRNA expressions of cell cycle-related genes were down-regulated in the 17-AAG treated group compared with control. Also, the expression of the pro-apoptotic gene Bax increased in 17-AAG treated group, whereas expression of the anti-apoptotic gene Bel-XL decreased. However, the expression of ER stress-related genes did not changed by 17-AAG. Cultured pESF cells were treated with or without 17-AAG and used for MIT assay. The results showed that viability of pESF cells were decreased by treatment of 17-AAG ($2{\mu}M$) for 24 hr. These results indicated that 17-AAG decreased cell proliferation and increased cell death. Expression patterns Hsp90 complex genes (Hsp70 and p23), cell cycle-related genes (cdc2 and cdc25c) and apoptosis-related genes (Bax and Bcl-XL) were significantly changed by using RT-PCR analysis. The spliced form of pXbp-1 product (pXbp-1s) was detected in the tunicamycin (TM) treated cells, but it is not detected in 17-AAG treated cells. In conclusion, Hsp90 appears to play a direct role in porcine early embryo developmental competence including structural integrity of blastocysts. Also, these results indicate that Hsp90 is closely associated with cell cycle- and apoptosis-related genes expression in developing porcine embryos.

• 한국가금학회지
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• 제43권2호
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• pp.77-88
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• 2016

본 연구에서는 국산종계 개발을 위하여 5계통의 토종닭 순계를 이용하여 $5{\times}5$ 이면교배조합 시험을 수행하고, 공시된 25계통에 대한 스트레스 반응 정도를 비교 분석하였다. 스트레스 반응정도 표지로 텔로미어 함량 및 감축율, 열 스트레스 단백질 유전자(HSPs)로 HSP-70, $HSP-90{\alpha}$, $HSP-90{\beta}$의 발현율 및 DNA 손상율을 이용하여 분석하였다. 텔로미어 함량은 양적 형광접합보인법을 이용하고, HSPs 발현율은 quantitative real-time PCR 기법으로, DNA 손상율은 Comet assay법을 적용하였다. 분석 결과, 교배조합 25계통 간 텔로미어 함량과 감축율, HSPs 유전자 발현율 및 DNA 손상율 모두에서 유의한 차이를 보였고, 더불어 계통 간 체중 및 생존율에도 유의한 차이가 나타났다. 텔로미어 감축율, HSPs 유전자 발현율 및 DNA 손상율 모든 분석 값에서 W 및 Y 계통과의 교잡구가 다른 교잡구에 비해 유의하게 낮은 값을 보였고, 반면 G계통의 순계구가 가장 높은 값을 나타내었다. 생존율과 스트레스 표지 값들 간의 상관계수를 추정한 결과, 텔로미어 함량과는 저도의 정(+)의 상관, HSP-70, $HSP-90{\alpha}$, $HSP-90{\beta}$ 및 DNA 손상율과는 중도 및 저도의 부(-)의 상관을 나타내었다. 또한 폐사 개체와 생존 개체 간 HSP-70, $HSP-90{\alpha}$ 및 $HSP-90{\beta}$의 발현율을 비교 분석한 결과, 폐사 개체의 HSPs 발현율이 생존 개체에 비해 유의하게 높은 발현율을 보였다. 이상 스트레스 표지 값의 분석 결과를 종합할 때, 교잡계들이 순계에 비해 스트레스 저항성이 높은 것으로 판단되고, 더불어 W, Y와 같은 경량종 계통의 교잡계들이 외적 스트레스에 강한 반면, G, H, F와 같은 고체중 계통의 교잡계들은 스트레스에 민감한 것으로 사료된다.

• 한국가금학회지
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• 제44권1호
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• pp.1-9
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• 2017

본 연구는 한국재래계(KNC)와 백색레그혼(WLH)에서 lipopolysaccharide(LPS)감염 스트레스가 닭의 품종간 스트레스 연관 유전자들의 발현에 미치는 영향을 비교 분석하고자 실시되었다. 공시계를 대상으로 생리식염수(대조구)와 LPS(처리구)를 복강에 투여한 후, 시간(0, 48 hr) 및 처리별 각 개체로부터 간 조직을 취하고, microarray 및 quantitative RT-PCR(qRT-PCR) 분석을 하였다. 처리에 따른 유전자 발현차이를 보면, KNC(대조구)와 KNC에 LPS를 처리한 경우(KNC-LPS)를 비교한 결과, 대조구 대비 2배 이상 유전자의 발현이 증가한 유전자의 수는 1,044개, 발현이 감소한 유전자의 수는 1,000개였다. WLH(대조구)를 WLH-LPS와 비교한 경우, 유전자의 발현이 증가한 유전자의 수는 1,193개, 발현이 감소한 유전자의 수는 1,072개였다. LPS 처리에 따른 스트레스 연관 유전자들의 microarray 발현에서 스트레스연관 유전자들의 발현은 두 품종 모두에서 감소하였으며, 품종 간 차이는 없는 것으로 나타났다. Microarray의 결과를 바탕으로 HSP90, HMGCR, ATF4, SREBP1, XBP1 등의 유전자 발현을 qRT-PCR을 이용하여 검증한 결과, 대조구와 LPS 감염구 간에 유의적 차이를 나타내었다(P<0.05). 세포 수준의 스트레스(ER 스트레스)에서 ATF4, XBP1, SREBP1은 화이트레그혼에서 microarray와 qRT-PCR에서와 같이 이들 유전자들의 발현이 억제되는 것을 보여주었다. 그러나 한국 재래계에서는 ATF4를 제외한 유전자들은 LPS에 의해 영향을 받지 않거나(XBP1), 오히려 증가(SREBP)하는 양상을 보였다. ER-stress 연관 유전자들의 발현 양상으로 볼 때, KNC이 WLH에 비하여 LPS 감염에 더 민감하게 반응하는 것으로 보인다. HMGCR은 두 품종간에 LPS에 의한 상호작용이 없는 것으로 보아, HMGCR 발현에 의한 감염 차이점을 찾을 수 없었다. 한국재래계에서 HSP70은 LPS 처리 후에 대조구에 비하여 약 2.5배 이상 높은 발현을 보였으나, 백색 레그혼에서는 낮은 발현 양상을 나타내었다. 스트레스 지표 유전자들의 종류뿐만 아니라, 스트레스 종류(예: 환경스트레스, 감염스트레스)에 따라 유전자들의 발현 반응에 차이가 있음을 보여주었다. LPS 감염스트레스에 따른 스트레스연관 유전자 발현연구는 닭의 품종별 질병 저항성 및 동물복지 관련 지표의 탐색에 기여할 것으로 사료된다.

• 한국가금학회지
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• 제47권2호
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• pp.95-105
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• 2020

본 연구는 한국토종닭 5품종 (재래황갈종, 토착로드종, 토착레그혼종, 토착코니시종 및 한국오계)에 대한 생산 특성 및 생리적 특성을 제시하고자 이들의 생산능력, 강건성 및 스트레스 반응 정도를 살펴보았다. 분석 대상으로 총 493수를 공시하고, 생산능력의 평가를 위해 생존율, 체중, 초산일령, 산란율 및 난중을 조사하였고, 강건성 및 스트레스 반응정도를 측정하기 위하여 텔로미어 함유율, heterophil-lymphocyte 비율, HSP-70, HSP-90α 및 HSP-90β 유전자 발현율을 분석하였다. 실험 결과, 생존율은 토착로드종이 99%로 가장 높았고, 한국오계가 91%로 가장 낮았다. 발생시부터 50주령까지의 체중은 토착코니시종, 토착로드종, 한국재래닭, 한국오계, 토착레그혼종의 순으로 변동없이 높게 나타났다. 22주령부터 50주령까지의 평균일계산란율은 토착레그혼종이 75%로 가장 높았고, 토착코니시종이 10%로 가장 낮게 나타났다. 생리적 지표 분석 결과, 텔로미어 함유율은 토착로드종이 가장 높았으며, 토착코니시종이 가장 낮았다. Heterophil-lymphocyte 비율 및 HSP-90β 유전자 발현율은 공히 토착코니시종이 가장 높았으며, 토착로드종이 가장 낮게 나타났다. 이러한 결과들은 토착로드종이 스트레스에 저항성이 높고, 토착코니시종이 스트레스에 가장 민감하게 반응함을 의미한다. 이상의 결과들을 종합할 때, 토착코니시종은 한국형 토종 육용 품종으로 개량함이 바람직하고, 토착레그혼종은 한국형 토종 난용 품종으로 개량하는 것이 바람직할 것으로 사료된다. 더불어 토착로드종은 양호한 생산능력과 뛰어난 강건성을 기반으로 한국형 토종닭 종계 모계통으로 활용하는 것이 바람직하리라 생각되고, 재래황갈종은 우수한 육질을 바탕으로 차별화 된 고급육질형 토종닭 품종으로 개량하는 것이 바람직하리라 사료된다.

• 한국가금학회지
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• 제43권3호
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• pp.177-189
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• 2016

본 연구는 닭의 개체 별 스트레스 연관 표지의 발현도와 이들의 생산능력 간의 연관성을 살펴보기 위한 것으로 토종종계 25계통을 대상으로 텔로미어 함량, 열 스트레스 단백질(HSPs) 유전자 발현율 및 DNA 손상율을 분석하고, 동일 개체들의 생존율, 성장능력 및 산란능력을 조사하여 이들 간의 상관관계를 분석 고찰하였다. 분석 결과, 생산능력 및 스트레스 표지 값들 간에 계통별로 유의한 차이가 나타났는데, 대체적으로 고체중 순계들의 스트레스 지표가 상대적으로 높았으며, 저체중 교잡계들의 스트레스 지표가 낮게 나타났다. 텔로미어 함량과 생산능력 간의 상관성은 20주령 이후부터 유의한 상관관계를 보였는데, 성장능력과는 약한 부(-)의 상관 양상을, 산란능력 및 생존율과는 약한 정(+)의 상관관계를 나타내었다. HSPs 유전자 발현율과 생산능력과의 상관에서 생존율 및 산란지수와는 저도 및 중도의 부의 상관을 보였고, 체중과는 약한 정의 상관관계를 나타내었다. DNA 손상율 분석 또한 체중과는 약한 정의 상관을, 산란지수 및 생존율과는 중도 및 저도의 부의 상관관계를 나타내었다. 이는 체중이 증가할수록 HSPs 유전자 발현율, DNA 손상율 및 텔로미어 감축량이 증가함을 의미하고, 반면 산란능력 및 생존율이 높을수록 HSPs 유전자 발현율과 DNA 손상율은 낮아지고, 텔로미어 함량은 상대적으로 높다는 것을 시사한다. 스트레스 표지 인자들 간의 상호 관계에서 모든 표지 값 간에 유의한 상관관계가 나타났는데, HSPs 발현값과 텔로미어 함량과는 부의 상관을, DNA 손상율과는 정의 상관을 보이고, 텔로미어 함량과 DNA 손상율과는 높은 부의 상관을 나타내었다. 이상의 스트레스 표지 값과 생산능력 간의 상관분석 결과에 따라 닭에 있어 HSPs 및 DNA 손상율의 증가는 텔로미어 감축을 촉진하고, 이에 따라 개체의 항병성 및 강건성을 저하시켜 산란능력과 생존율에 나쁜 영향을 미치는 것으로 판단된다.