본(本) 연구(硏究)는 유단백질(乳蛋白質)의 유전적표식(遺傳的標識)(genetic marker)를 유우(乳牛)의 유전적(遺傳的) 개량(改良)을 위한 유우등록 및 선발(選拔) 자료로 활용하고자 1992년 국립 종축원에서 사육증인 Holstein종 159두에서 각각 유즙 시료를 채취하여 Polyacrylarnide gel(PAGE)에 의한 전기영동방법에 의하여 ${\alpha}S1$-casein(${\alpha}S1$-CN) 및 ${\beta}$-casein(${\beta}$-CN), ${\kappa}$-casein(${\kappa}$-CN) 및 ${\beta}$-lactoglobulin(${\beta}$-LG)의 유전적(遺傳的) 다형(多型)을 분석(分析)하여 유전적(遺傳的) 변이체의 표현형(表現型), 유전자형(遺傳子型) 및 유전자빈도(遺傳子頻度)를 추정하고 이들 단백질의 유전적(遺傳的) 다형(genetic polyrnorphisms)과 유조성분과의 연관성을 분석(分析) 검토(檢討)하였다. 유단백질(乳蛋白質)인 ${\alpha}S1$-CN, ${\beta}$-CN, ${\kappa}$-CN 및 ${\beta}$-LG 유전좌위(遺傳座位)의 유전적(遺傳的) 변이체의 표현형(表現型) 분포의 관찰치와 기대치간에 유의적(有意的)인 차이가 인정 되지않아 이들 유전자(遺傳子)들이 유전적(遺傳的) 평형을 이루고 있는 것으로 사료되었다. 유단백질(乳蛋白質) 좌위(座位)의 유전자형(遺傳子型)을 분석(分析)한 결과(結果) ${\alpha}S1$-CN BB유전자형(遺傳子型), ${\beta}$-CN AA유전자형(遺傳子型), ${\kappa}$-CN AA유전자형(遺傳子型) 및 ${\beta}$-LG AB 유전자형(遺傳子型)의 출현빈도(出現頻度)가 각각 79.87%, 84.28%, 71.70% 및 49.10%로 높게 나타났다. 유단백질(乳蛋白質)의 유전자빈도(遺傳子頻度)에 있어서는 ${\alpha}S1-CN^B$와 ${\alpha}S1-CN^C$가 각각 0.899 및 0.101이었고, ${\beta}-CN^A$ 및 ${\beta}-CN^B$은 각각 0.921 및 0.079이었으며, ${\kappa}-CN^A$ 및 ${\kappa}-CN^B$은 각각 0.837 및 0.163이었고, ${\beta}-LG^A$ 및 ${\beta}-LG^B$은 각각 0.378 및 0.622이었다. 분산분석(分散分析) 결과(結果) 유단백질(乳蛋白質)의 유전자형(遺傳子型)들은 유조성분인 유지율, 단백질 함량 및 총 고형분 함량에서 유의적(有意的)인 연관성이 인정되었다. 유조성분 함량에 있어서는 ${\kappa}$-CN좌위(座位)의 BB유전자형(遺傳子型)은 유지율 및 유단백질(乳蛋白質) 함량에서 ${\kappa}$-CN좌위(座位)의 AA 및 AB 유전자형(遺傳子型)보다 유의적(有意的)으로 높게 나타났으며, ${\beta}$-LG좌위(座位)의 AA유전자형(遺傳子型)은 유지율에서 ${\beta}$-LG좌위(座位)의 AB 및 BB 유전자형(遺傳子型)보다 유의적(有意的)으로 높게 추정되었다. 이상의 연구결과(硏究結果)를 종합하여 볼때 유조 성분인 유지율 및 단백질함량을 높히기 위하여서는 ${\kappa}$-CN좌위(座位)의 BB 유전자형(遺傳子型)과 ${\beta}$-LG좌위(座位)의 AA 유전자형(遺傳子型)을 선발(選拔)하는것이 보다 유리할 것으로 생각되었다.
표식 유전자를 이용하여 체세포 잡종체를 선발하기 위한 연구의 일환으로 감자조직에는 T-DNA를 도입하여 식물호르몬 무첨가 배지에서도 생장가능한 형질전환체을 획득하고, 담배조직에는 NPT H gene을 도입하여 kanamycin에 대해서 저항성을 나타내는 형질전환체를 획득하여 각각의 특성구명과 원형질체를 유리하여 도입된 유전자 marker를 이용해서 융합을 시도한 바 그 결과는 다음과 같다. 1. 감자 괴경에서 Agrobacterium tumefaciens Ach5와 A. rhizogenes ATCC15834를 접종하여 crown gall tumor 및 hairy root를 유기하였으며 이러한 tumor조직은 식물 호르몬 무첨가 배지에서 생장이 가능하였다. 2. 감자에서 유기된 hairy root로부터 callus 형성은 2.4-D 2mg/1 첨가된 MS 배지에서 가장 양호하였으며 casein hydrolysate 1g/1가 첨가하면 유연 한 callus의 증식이 더욱 왕성하였다. 3. Activated charcoal이 0.5~2.0g/1 첨가된 배지에서는 crown gall tumor callus의 절단면이 갈변되는 것을 방지 할 수 있어 생존률을 높일 수 있었으나 hairy root에서는 갈변되어 고사되었다. 4. 2, 4-D 2mg/1와 casein hydrolysate 1g/1를 첨가한 배지에 hairy root callus를 현탁배의한 결과 양호한 많은 callus 덩어리들을 단시간에 얻을 수 있었다. 5. $Tri^-$parental mating으로 NPTII gene이 coding되어있는 binary vector인 pGA643을 wild type 및 disarmid된 Agrobacterium 내에 도입하여 Agrobacterium tumefaciens Ach5/pGA643, A.tumefaciens $A_4T$/pGA643, A. tumefaciens LBA4404/pGA643를 획득하였다. 이 세 개의 conjugant를 사용하여 0.7% agarose gel 상에서 pGA643을 확인하였다. 6. pGA643이 도입왼 Agrobacterium tumefaciens LBA4404와 담배 조직과 동시배양하여 kanamycin $100\mug$/ml 첨가된 배지에 생존하는 callus를 선발하였으며 동일배지에서 callus의 증식이 가능하였다. 7.형질전환된 담배 callus로부터 식물체 형성은 BA 2mg/1를 첨가한 배지에서 가능하였다. 8. 재분화된 담배의 엽조직은 kanamycin.이 $1000\mug$/ml 첨가된 MS 배지에서도 왕성히 callus가 유기되어, 이는 재분화체에서도 NPTII gene이 그대로 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 9. 담배의 정상 shoot와 형질전환된 shoot를 kanamycin이 $100\mug$/ml이 함유된 MS배지에 기내삽목한 결과, 정상 shoot는 발근이 되지 않고 황화 되었으나 형질전환된 shoot는 발근이되었으며 정상적으로 생장을 하였다. 10. 감자의 T-DNA가 도입된 현탁배양 callus는 cellulase 2%, macerozyme 2%, dricelase 1%에서 양호하게 유리되었다. 11. Osmoticum으로서 mannitol 농도 0.8M에서 담배와 감자의 두 조직 모두 원형질체유리가 가장 효과적이었다. 생존력은 T-DNA가 도입된 감자의 hairy root를 callus로 탈분화 시킨 후 현탁배양한 callus가 mannitol 0.5M에서 97%를 나타냈고, 그리고 NPTII gene이 도입된 담배의 엽조직은 mannitol 0.7M에서 94%로 최고를 타나냈다. 12. 원형질체 융합은 PEG solution 처리 15분 후부터 관찰되기 시작하여 20분에 완전히 융합되었고, 융합된 원형질체는 선발 marker인 호르몬 무첨가 및 kanamycin 첨가배지에서 배양 5일 후에 세포벽이 재생되었으며 4주일 후부터 colony들이 관찰되었다.
눈조직의 젖산탈수소효소(LDH, EC 1.1.1.27) eye-specific $C_4$ 동위효소의 특성을 native-PAGE, Western blotting, 면역침강반응 및 효소 역학을 이용하여 연구하였고, LDH eye-specific $C_4$ 동위효소의 활성을 측정하는 조건을 제시하였다. 파랑볼우럭(Lepomis macrochirus)과 큰입우럭(Micropterus salmoides) 눈조직의 세포기질에서 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소가 확인되었으며 $B_4$ 동위효소보다 $A_4$ 동위효소에 유사하였다. 파랑볼우럭 눈조직의 LDH/CS는 9월에 증가하여 혐기적 대사가 높게 이루어졌다. 파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직 미토콘드리아 LDH의 전기영동상은 세포기질 LDH와 유사하였다. 눈조직의 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소는 Preparative native-PAGE에 의해 정제되었다. 파랑볼우럭과 큰입우럭의 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소의 활성은 피루브산 0.2 mM과 0.1 mM 이상의 농도에서 각각 감소되었고, 피루브산 10 mM에서 5.2%, 15.8% 활성이 남아 저해 정도가 크게 나타났다. 그리고 눈조직의 LDH 활성도 젖산 22 mM과 24 mM 이상의 농도에서 각각 감소되어졌다. 파랑 볼우럭 eye-specific $C_4$ 동위효소의 $Km^{PYR}$는 0.088 mM, 큰입우럭 eye-specific $C_4$$Km^{PYR}$는 0.033 mM였으며, 세포기질과 미토콘드리아 eye-specific $C_4$ 동위효소는 ${\alpha}$-ketobutyric acid에서 활성이 높게 나타났다. 눈조직과 eye-specific $C_4$ 동위효소의 활성은 피루브산 0.5 mM과 Tris-HCl 완충액, pH 7.5에서 측정하는 것이 적합한 것으로 확인되었다. 실험 결과, 큰입우럭 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소는 파랑볼우럭 LDH eye-specific $C_4$보다 피루브산에 대한 친화력이 큰 것으로 확인되었고, 더 낮은 피루브산의 농도에서 최대 활성에 이르고, 더 높은 젖산의 농도에서 최대 활성을 나타냈다. 따라서 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소에 의해 생성된 에너지가 포식 행동의 초기 반응에 사용되는 것으로 사료된다.
목적 : 방사선 조사에 의하여 유발되는 세포고사의 신호전달기전, 특히 caspase계 cysteine protease의 활성화, Bcl2 및 Bax 단백질, cytochrome c의 세포질내로의 방출, Fas 와 Fas-L 단백질의 발현양상 등의 조사를 통하여 방사선 조사에 의하여 유발되는 세포고사기전을 규명하고자 하였다. 대상 및 방법 : HL-60 세포주에 6 MV의 X-선을 조사하고 세포생존율, Caspase의 활성도, $Bcl_2$ 및 Bax 단백질, cytochrome c의 세포질내로의 방출여부, 및 Fas 와 Fas-L 단백질의 발현양상을 조사하였다. 결과 : 방사선조사 후 세포의 생존율은 조사선량과 조사 후 시간경과에 따라 감소되었다. 세포고사의 특징인 사다리형 DNA 분절은 방사선조사 4시간 후부터 시간경과에 따라 증가하였으며, 조사선량이 증가할수록 더욱 현저하였다. 방사선조사 후 caspase계 cysteine proteases 중 caspase-2, 3, 6, 8 및 9의 활성화가 시간경과에 따라 증가하였으며, 16 Gy의 방사선량조사 4시간 후에 poly (ADP-ribosyl) polymerase (PARP)의 분절과 Western blot을 이용한 procaspase-3의 분절을 확인함으로서 caspase-3의 활성을 간접적으로 증명할 수 있었다. $Bcl_2$ 단백질은 방사선조사 후 시간경과에 따라 감소하였으며, Bax 단백질은 시간경과에 따라 발현이 증가하는 양상을 관찰할 수 있었다. 방사선조사 후 cytochrome c의 세포질내로의 방출을 확인하였다. 또한 Fas 및 Fas-L 단백질 모두 방사선조사 후 발현이 증가하는 양상을 관찰할 수 있었다. 결론 : HL-60 세포주에서 방사선 조사에 의해 유발되는 세포사멸이 세포고사기전에 의해서 매개됨을 확인하였으며, 이는 세포내 caspase계 cysteine proteases, $Bcl_2$, Bax, 세포질내로의 cytochrome c 방출 그리고 Fas, Fas-L가 관여하는 신호전달경로의 활성화에 의한 것임을 의미하였다.
국내 감자품종들의 품종간 유연관계를 분석하고 품종구분을 위한 DNA 표지인자를 개발하기 위하여 SSR(simple sequence repeats) 분석 및 다중초위성체 마커세트(multiplex-SSR set)를 개발하였다. 기존에 보고된 92개의 SSR 마커를 디자인 하고 이들을 이용하여 국내에서 육성된 24개 감자 품종에 대해 유전적 다양성을 분석하였다. 92개의 SSR 마커 중 PIC(polymorphism information contents) 값이 높은 14개의 SSR 마커를 선발하였고 PIC 값은 SSR 마커별로 0.48에서 0.89로 나타났고, 평균 값은 0.79였다. PSSR-29의 PIC 값은 0.48로 가장 낮은 값을 나타내었으며 PSSR-191에서 0.89로 가장 높은 값을 보였다. 선발된 14개의 SSR 마커를 이용하여 UPGMA 집괴분석 결과 24개의 감자 품종 중 21개의 품종이 2개의 집단으로 구분 할 수 있었으며 I 집단과 II 집단에는 각각 16개, 5개의 품종들이 군집되었으나 3개의 품종은 군집되지 않았다. 선발된 14개의 SSR 마커를 이용한 결과 24개의 품종에서 총 121개의 대립인자가 확인되었으며 각 마커별 대립인자는 3개에서 34개까지 확인되었고 평균 10.8개로 나타났다. 선발된 SSR 마커 중에서 PSSR-17, PSSR-24, PSSR-29 마커를 조합하여 다중초위성체 마커세트(multiplex-SSR set)를 개발하였다. 다중초위성체 마커세트는 한번의 PCR 반응과 PAGE 분석 만으로 본 연구에서 사용된 국내 24개의 감자 품종을 구분할 수 있었며 PIC 값은 0.95로 나타났다.
본 연구는 식염과 지방 그리고 여러 가열조건에 의한 pH 및 일반성분, 가열감량 및 단백질 용해성의 변화에 따른 단백질 분획의 변화에 대해 분석하였다 처리구에 따른 가열감량 (CL, %)은 지방의 첨가에 상관없이 식염을 2%첨가한 경우 식염을 첨가하지 않은 경우에 비하여 약 1/2배 정도 낮은 가열감량을 보였다. 한편, 식염 무첨가구의 경우 지방을 첨가한 경우 가열감량은 유의적으로 낮았으나, 식염 2%첨가구는 지방 첨가에 따른 가열감량의 유의적 차이가 나타나지 않았다. 그리고 가열온도에 따른 가열감량은 $66^{\circ}C$까지는 점진적으로 증가하다가 $68^{\circ}C$ 보다 높은 가열온도에서 유의적으로 증가하는 경향을 보였다. 식염 무첨가구와 식염 2% 첨가구 사이에서는 단백질 용해성의 유의적인 차이가 없었으나 지방이 첨가된 경우 상대적인 단백질 함량의 감소로 단백질 용해성이 유의적으로 감소하였다. 가열 온도가 높아짐에 따라 용해성의 감소가 현저히 나타났으나 $68^{\circ}C$ 이상의 가열온도에서는 단백질 용해성이 유의적 차이 없이 일정한 수준을 유지하였다. 추출한 근장 단백질이 각 처리구별 가열온도에 따른 단백질 분획을 분석하기 위해 전기영동을 실시한 결과 식염, 지방 그리고 가열에 따라 특이적으로 반응한 것은 36 과 66 kDa의 분자량을 가진 근장 단백질 분획이었다. 이러한 단백질 분획은 최종가열온도가 66 ${\sim} 70^{\circ}C$에서 급격히 thtlfehladmfhTJ 돈육의 최종 가열온도 측정을 위한 지시제로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
목 적 : 세균성 이질은 1998년 이후로 발생률이 증가하는 추세에 있고 그 발생이 주로 집단시설 생활자, 학교 단체급식 등을 통해서 이루어지고 있다. 집단 발병한 세균성 이질을 통해 발병양상과 임상경과를 알아보고자 하였다. 방 법 : 2005년 10월부터 11월 사이에 국립의료원 소아과에 입원했던 세균성 이질환자 및 유사환자 모두 32명 대상으로 감염원, 역학, 미생물 검사 및 PFGE 검사를 하였다. 결 과 남아가 17명, 여아가 15명으로 환아들의 연령은 생후 5개월부터 12세까지 연령분포를 보였으며 평균나이는 6.5세였다. 임상 증상은, 설사는 이질환자에서 22명 유사환자에서 7명, 열은 이질환자에서 18명, 유사환자에서 3명, 무증상인 경우도 이질환자에서 1명, 유사환자에서 1명 있었다. 임상증상 지속시간은 대개 3~4일 정도로 짧았고, 직장채변 대변배양검사에서 모두 S. sonnei가 배양되었고 ampicillin, streptomycin, gentamicin, nalicidic acid, TMP/SMX에 내성을 보였으며 3세대 cephalosporin에 감수성을 보였다. 환아들의 치료는 전해질 및 수분공급의 보존적 치료와 함께 3세대 cephalosporin으로 항생제 치료를 병행한 후, 증상이 호전되었으며 직장채변 대변 배양검사에서 이질균 음성으로 나왔다. 이번의 세균성 이질의 집단 유행에서 관내 어린이집의 음식물 검사 및 음용수검사 등에서 감염원은 찾지 못하였다. 세균성 이질로 확진된 24례의 환자 중 3세대 cephalosporin에 감수성이 있는 것으로 알려진 3례에서 cefixime 투여 후에도 직장채변 대변배양검사에서 계속 균이 배양되어 Imipenem으로 대체하여 6일간 투여 후 시행한 연속 3회의 대변배양검사에서는 이질균이 검출되지 않았다. 결 론 : 서울시내 세균성 이질균의 집단 발병의 감염원은 발견되지 않았고, 어린이집과 2차 감염에 의해 초등학교 및 그 가족으로 전파가 이루어졌던 것으로 추정되며, 항생제 감수성 검사와 PFGE 결과에 의하면 같은 균주로 판명되었다. 환아들은 3세대 Cephalosporin 치료 후 대부분 호전되었고 3례만 Imipenem을 추가로 투여하여 치료하였다.
Campylobacter jejuni는 사람에서 매우 중요한 식중독 원인균의 하나이며, 2010년 경기도내 병원을 내원한 설사 환자와 4번의 식중독 outbreak에서 42균주를 분리하였다. 본 연구에서는 분리된 C. jejuni 42균주의 유전적 특성과 혈청형, 항균제 내성율을 분석하였다. hipO 종특이 유전자(100%), cdtB 독소 유전자(100%)가 검출되었고, gyrA 돌연변이 유전자(95.2%)가 PCR 실험결과 검출되었다. gyrA 돌연변이 유전자는 ciprofloxacin 내성과 연관이 깊으며, 디스크 확산법에 의해 실험한 결과 gyrA 돌연변이 유전자가 검출된 40균주(95.2%)에서 실제 ciprofloxacin에 대해 내성을 보였다. 분리된 42균주 C. jejuni에 대한 gyrA 유전자의 염기서열을 분석한 결과 ciprofloxacin에 내성을 가진 40균주에서 아미노산 서열이 ACA (트레오닌)에서 ATA (이소루신)으로 돌연변이 되어있음을 확인하였다. 하지만 대체 치료제인 erythromycin과 azithromycin에 대해서는 97.6% (41균주) 감수성을 보였다. 또한 C. jejuni의 혈청형을 분석한 결과 4가지 타입으로 분류되었는데, HS2(B), HS3(C), HS4(D), HS19(O)로 확인되었다. 도내에서 분리한 C. jejuni 42균주의 유전형을 rep-PCR과 PFGE로 확인한 결과 PFGE에 의해서는 12 cluster, rep-PCR에 의해서는 11 cluster의 유전형으로 구분되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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