An $\alpha$-D-galactosidase ($\alpha$-D-galactoside galactohydrolase, EC 3. 2. 1. 22) from earthworm was purified by affinity chromatography using N-$\varepsilon$-aminocaproyl-$\alpha$-D-galactopyranosylamine coupled to sepharose and its properties were examined. The specific activity of the purified enzyme, tested with p-nitrophenyl-$\alpha$-D-galactopyranoside as substrate, was 314 units/mg protein, representing an 122-fold purification of the original crude extract. The final preparation obtained from by Sephadex G-25 chromatography showed a single band on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The molecular weight was determined to be 48,000 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The purified galactosidase was showed maximum activity at pH 4.5 and 4$0^{\circ}C$, and was stable in the pH and temperature ranges from 4.0 to 5.5 and 30 to 5$0^{\circ}C$, respectively. The enzyme activity was inhibited by Zn2+, Hg2+ and Co2+. When the purified $\alpha$-galactosidase treated to guar gum for 6 hour, gel-promoting property was increased. It was clear that enzymatic elimination of galactose from guar gum by purified $\alpha$-galactosidase would lead to a significant increase in gelation ability.
자연계에서 분리, 동정한 호알칼리성, 고온성 Bacillus sp. TA-11의 $\beta$-galactosidase 생합성 조절 기작을 조사 하였다. 시험균주의 $\beta$-galactosidase 생합성은 isoprophyl-$\beta$-Dthiogalactopyranoside (IPTG) 보다 lactose에 의해 더욱 효과적으로 유도 되었고 glucose는 lactose의 세포내 유입을 방해하면서 $\beta$-galactosidase의 생합성을 억제 하였다. 또한 이러한 glucose의 효소합성 억제효과는 cAMP에 의해 완하되지 못했다.
This paper investigates the production and optimization of $\beta$-galactosidase enzyme using synthetic medium by Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 in stirred tank bioreactor. Response surface methodology was used to investigate the effects of fermentation parameters on $\beta$-galactosidase enzyme production. Maximum specific enzyme activity of 4,622.7 U/g was obtained at the optimum levels of process variables (aeration rate 2.21 vvm, agitation speed 173.4 rpm, initial sugar concentration 33.8 g/L, incubation time 24.0 hr). The optimum temperature and pH of the $\beta$-galactosidase enzyme produced under optimized conditions were $37^{\circ}C$ and pH 7.0, respectively. The enzyme was stable over a pH range of 6.0-7.5 and a temperature range of $25-37^{\circ}C$. The $K_m$ and $V_{max}$ values for O-nitrophenol-$\beta$-D-galactopyranoside (ONPG) were 1.20 mM and $1,000\;{\mu}mol/min{\cdot}mg$ protein, respectively. The response surface methodology was found to be useful in optimizing and determining the interactions among process variables in $\beta$-galactosidase enzyme production. Hence, this study fulfills the lack of using mathematical and statistical techniques in optimizing the $\beta$-galactosidase enzyme production in stirred tank bioreactor.
A gene coding for the $\beta$-galactosidase (lactase) of Kluyveromyces tragilis UCD 55-55 was isolated by complementation in Escherichia coli YMC9. From the plasmid library made from Sau3A-digested chromosomal DNA, one positive clone was selected. The cloned gene for $\beta$-galactosidase was on 7.3 kilobase pair DNA fragment, and a slightly low level of $\beta$-galactosidase enzyme activity was detecied in E. coli. It was also confirmed that the cloned gene comes from K. tragilis by DNA-DNA hybridization and immunochemical blotting experiments. In order to construct a new yeast strain having the metabolic ability for lactose, the cloned gene for K. tragilis $\beta$-galactosidase was inserted in yeast vector YEp24 and YRp17, and transformed into Saccharomyces cerevisiae YNN27 and Ml-2B. The yeast transformants showed the nearly the same $\beta$-galactosidase productivity as level of K. tragilis when uninduced, but these could not utilize lactose as a sole carbon source, presumably due to the lack of lactose transport system. Nevertheless, a slightly higher ethanol productivity was achieved by these transformants than S. cerevisiae or K. tragilis, in the medium containing glucose and lactose.
Aspergillus phoenicis의 ${\beta}-galactosidase$ 활성을 ONPG와 lactose를 기질로서 사용하여 조사하였다. 이 효소 활성은 성장의 대수기 동안은 서서히 증가하였으나 정지기가 시작되면서 급격하게 감소하였다. 또한 이 효소는 높은 온도에서도 좋은 효소 활성을 유지하였으며, 산성 pH에서 최고의 효소활성을 나타내었다. ${\beta}-galactosidase$는 lactose보다 ONPG에 대한 기질의 친화력이 더 좋았으며, 효소 활성도 ONPG의 경우가 더 높았다. Lactose의 가수분해율은 반응액중의 lactose의 농도가 낮을 수록 높았으며, 사용균의 무게에 따라 초기에는 증가하다가 어느 수준 이상에서 부터는 점근값을 나타내었다. 효소의 활성은 효소의 고정 방법 및 조건에 영향을 받았으며, matrix의 가교가 pH 7.2 및 0.35 vol. %의 glutaraldehyde 농도에서 행하여졌을 때, 가장 높은 효소 활성을 보였다.
$\beta$-galactosidase를 강력하게 생산하는 호알칼리성, 고온성 세균 TA-11를 부엽토에서 분리하여 Bacillus sp. TA-11로 동정 하였다. Bacillus sp. TA-11에 의한 $\beta$-galactosidase 생산은 lactose 1.5%, peptone과 yeast ext. 각각 0.4%, $MgSO_4$ 0.2%, $NH_4$CL 0.05% 및 NaCl 0.2% 등을 함유한 배지의 pH를 10.0으로 하여 시험균을 접종한후 $50^{\circ}C$에서 2일간 진탕배양 하였을 때 가장 좋았다.
p-Aminopheny1-$\beta$-D-thiogalactopyranoside agarose 친화성 크로마토그라피를 이용하여 Neisseria lactamica 2118이 생성하는 $\beta$-galactosidase를 정제한 후 몇가지 효소학적 성질을 조사 하였다. Neisseria lactamica 2118이 생성하는 $\beta$-galactosidase는 구성효소로서 lactose와 IPTG에 의하여 유도되지 않았다. 정제효소의 작용최적온도는 $35^{\circ}C$, pH는 7.5이었고 $50^{\circ}C$로 15~60분 처리시 약 80%의 활성이 유지되었으며 pH 6.0~9.0에서 안정 하였다. 또한 $Hg^(2+)$와 $Co^(2+)$에 의하여 그 활성이 저해 되었다.
본 연구에서는 Bifidobacterium을 우유와 두유에 접종하여 $37^{\circ}C$에서 발효 특성, 적정 발효 기간 및 효율적인 증식을 위한 생육 인자를 찾고자 하였다. 이를 위하여 pH, 산도, glucose함량, 생균수, ${\alpha}-galactosidase$활성 그리고 ${\beta}-galactosidase$활성 변화를 조사하였다. $37^{\circ}C$에서 일반 발효 특성을 측정했을 때 48시간동안 우유의 발효는 pH의 감소와 산 생성의 증가는 현저한 반면, 세포 증식을 24시간동안 증가하였으나 남은 24시간동안은 감소를 보였다. 또한 효소 반응은 ${\beta}-galactosidase$ 활성이 높은 반면, ${\alpha}-galactosidase$는 비교적 낮았으며 glucose 함량은 세포 증식기에 높았다. 두유의 경우는 우유에 비해 pH의 감소가 큰 반면 적정산도 증가는 비슷하였다. 세포 증식은 발효 2일동안 이루어졌으며, ${\alpha}-,\;{\beta}-galactosidase$ 모두 활성이 높게 나타났고, glucose 함량도 1일 동안 지속적인 증가를 나타냈다. 또한 적정 발효기간은 발효유는 24-36시간, 발효 두유는 약 24시간이 바람직한 것으로 나타났다. Bifidobacterium의 성장 촉진 인자의 영향을 발효 시간에 따른 pH와 생균수 변화로 조사한 결과, 두유에서는 fucosyllactose, 그리고 우유에서는 발효 초기에 L-cysteine·HCl, 발효 진행중에는 fucosyllactose가 효과적인 생육 인자로 작용하였다.
[ ${\beta}-Galactosidase$ ] (lactase)를 생산하는 유산균을 선별하고 그들이 생산하는 ${\beta}-galactosidase$의 특성을 조사하였다. X-gal이 포함된 MRS배지에서 푸른색을 나타내는 약 100여개의 콜로니를 김치로부터 분리하였다. 그들 중 ET-1과 LA-12 두 균주를 최종 선별하였으며, 16S rDNa 염기서열 분석을 통해 각 각 Lactobacillus fermentum과 L. acidophilus와 상동성이 높은 Lactobacillus 속으로 동정되었다. 선별된 두 균주는 높은 ${\beta}-galactosidase$ activeity와 우수한 생존력을 나타내었으며, 이들이 생산하는 ${\beta}-galactosidase$의 최적 활성조건을 조사한 결과, 반응온도 $55^{\circ}C$에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 반응 pH의 경우 ET-1은 pH 5.5에서 최고 활성을 나타내었고, LA-12는 pH7.0에서 가장 높은 활성을 보였다. 선별 유산균 ET-1과 LA-12는 위액과 담즙산액에 대해 우수한 내성을 나타내었다. 두 개의 선별 균주는 인공위액에 3시간 배양 후 초기 생균수와 비교하여 생균수 변화가 거의 없었고, 담즙산액으로 사용한 0.3% oxgall에서 24시간 반응 후에도 1 log cycle 정도 감소된 $10^8CFU/ml$의 생균수를 유지하였다. 이러한 결과를 바탕으로 유산균 ET-1과 LA-12는 유제품 산업에 이용 가능성이 크다고 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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