• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제35권4호
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• pp.247-265
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• 2008

목 적: 사람의 제대유래 줄기세포 (HUC)와 양막유래 줄기세포 (HAM)를 간유사세포로 분화 시키고자 하였다. 연구방법: 산모의 동의아래 만삭 정상 산모로부터 양막 및 제대를 얻고 줄기세포를 분리, 배양하였다. 분리된 세포의 줄기세포로서의 특성을 규명하기 위하여 RT-PCR, 세포면역화학 분석 그리고 중배엽성세포로의 분화능 실험을 하였다. 또한 이들 줄기세포를 분화 배양액에서 간유사세포로 분화 유도 후, 간세포 특이 유전자 발현, 알부민 ELISA, 알부민에 대한 면역블로팅 및 세포면역화학염색 그리고 PAS 염색을 시행하였다. 결 과: 사람의 양막 및 제대로부터 세포를 분리하여 줄기세포로서의 특성을 조사하고, 이들 세포의 지방세포, 연골세포, 골아세포로의 분화능력을 확인하였다. 동일한 분화 배양액에서 HUC과 HAM을 간유사세포로 분화시킨 결과 HUC이 모든 조건에서 HAM보다 알부민과 요소를 더 많이 합성 분비하였다. 간유사세포로의 분화능력이 더 좋은 것으로 나타난 HUC을 가지고 최적의 분화를 유도한 결과 $1.2{\pm}0.8\;{\mu}g/mL$의 알부민을 합성 분비하였고, $8.9{\pm}1.2\;mg/dL$의 요소를 합성 분비하였다. 결 론: HUC과 HAM 모두 알부민을 분비하는 간유사세포로 분화할 수 있었으며, HUC이 더 잘 유도되는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과로써 HUC과 HAM을 간질환 환자의 간세포 이식 치료에 필요한 세포치료제로써 이용할 수 있을 것으로 생각된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제36권1호
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• pp.23-34
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• 2009

목 적: 중간엽 줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 체외 배양을 통한 세포증식 과정이 필요하나, 오랜 기간 동안 체외 배양을 하게 되면 노화되어 특성이 변하고 분화 능력 또한 감소하게 된다. 따라서 현재까지는 초기 계대배양의 세포만이 임상에 적용되고 있는 실정이며 체외에서의 세포 배양이 세포의 특성에 미치는 영향에 대한 연구와 함께 세포의 특성 변화 없이 체외증식이 가능하도록 하는 연구들이 골수 및 지방유래 중간엽 줄기세포에서 보고되고 있다. 그러나 현재 탯줄유래 줄기세포의 체외 배양에 따른 특성 변화 분석 연구는 아직 잘 이루어지지 않고 있다. 본 연구의 목적은 탯줄유래 줄기세포의 체외 배양 시 계대배양 증가에 따른 줄기세포의 특성 변화를 분석하고자 하였다. 연구방법: 사람의 탯줄유래 줄기세포 (human umbilical cord-derived stem cells, HUC)를 분리하여 in vitro에서 계대배양하였다. 계대배양에 따른 세포의 형태와 population doubling time (PDT)을 조사하고 RT-PCR 방법을 이용하여 mRNA 분석을 하였으며 면역세포화학 염색법을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 결 과: 탯줄유래 줄기세포는 평균 10번의 계대배양 후 senescence를 나타냈다. 세포의 형태는 7번째 계대배양 이후 세포질이 넓어지고 세포의 크기가 커지는 변화를 나타냈으며 PDT가 증가하기 시작하였다. 계대배양 4, 8, 10번째 시기의 세포의 mRNA 변화를 분석한 결과 Oct-4, HNF-4${\alpha}$, mRNA는 10번째 계대배양까지 지속적으로 발현하였으나 nestin, vimentin mRNA는 지속적으로 발현이 감소하였고 SCF mRNA는 지속적으로 발현이 감소하였다. 이에 반해 HLA-DR${\alpha}$, Pax-6, BMP-2 mRNA는 모든 계대배양 시기의 세포에서 발현되지 않았다. 면역세포화학 분석법을 통한 3, 6, 9번째 계대배양 세포의 단백질 발현 분석 결과 SSEA-3와 SSEA-4는 3, 6, 9번째 계대배양 세포 모두에서 발현하였으나 ICAM-1과 HLA-ABC는 계대배양이 증가함에 따라 발현이 증가되었다. Thy-1 단백질은 p9에서 발현이 증가되었으며 이와 반대로 TRA-1-60와 VCAM-1 단백질은 p6과 p9 시기에 발현이 감소되었다. HLA-DR 단백질은 모든 계대배양 시기에 발현되지 않았다. 결 론: 본 연구결과 탯줄유래 줄기세포는 체외 배양 시 줄기세포 특성이 일부 변하는 것을 관찰하였다. 앞으로 줄기세포의 특성을 유지할 수 있는 체외 배양법의 발달을 위한 연구들이 수행 되야 할 것으로 사료된다.

• 대한약리학회지
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• 제29권1호
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• pp.139-148
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• 1993

SCC 12와 SCC 13 세포주는 피부의 상피암 조직에서 유래되었다. 본 연구에서는, 세포배양으로 in vivo 피부의 거의 모든 특징들을 재현할 수 있는 raft 배양법을 이용하여, 두 종류의 상피 암세포주의 진피 침투성 정도를 비교해 보았다. SCC 12 세포주의 raft 배양에서는, collagen matrix로 침투하는 많은 세포군들이 관찰되었고, 또한 기저세포와 유사한 세포들이 분화층 중간에 관찰되었다. 그러나 SCC 13 세포주의 raft 배양에서는 침투성 세포들이 전혀 관찰되지 않았다. 어떤 인자가 SCC 12 세포주의 침투성에 관여하였는지를 조사하기 위하여, 세포이동 또는 matrix 파괴에 관여하는 각종 단백질 즉, type 1 collagenase, Fn, Fn 수용체와 EGF 수용체 등의 기본 생합성속도를 침투성과 비침투성 세포주에서 측정하였다. 그 중 type 1 collagenase의 생합성만이 침투성 세포주에서 현저히 높게 나타났다. 침투성 SCC 12 세포주에서 관찰된 높은 type 1 collagenase 생합성과 이들 세포주의 침투성과의 연관관계 및 그 기작을 조사하기 위하여 두 세포주에서 TGF alpha에 대한 반응의 차이를 조사하였다. 비침투성 세포주에서는, TGF alpha에 의해 type 1 collagenase의 생합성이 처음 12시간 동안에 현저한 증가를 보였으나 24시간부터 그 유도가 down-regulation되는 현상을 보였다. 그러나 침투성 세포는 TGF alpha에 의해 계속적인 type 1 collagenase의 유도를 보였다. 이에 저자들은 EGF 수용체의 down-regulation으로 인해 type 1 collagenase의 down-regulation이 유도되고, 이와 같은 regulation의 결함으로 인해 SCC 12 세포주가 collagen matrix로 침투하는 현상을 나타낼 것으로 제시하였다.

• 대한화장품학회지
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• 제26권1호
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• pp.163-186
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• 2000

Elastase (EC 3. 4. 4. 7)는 구조 단백질인 fibronectin, collagen 그리고 elastin을 포함한 다양한 단백질들을 분해한다. Elastase는 생체 염증 방어의 중요한 성분이며, $\alpha$$_1$-proteinase inhibitor ($\alpha$$_1$PI)와 같은 생체 내부에 있는 단백질 분해 효소 저해제들에 의해 조절된다. 그러나, 만성 염증의 결과, elastase와 $\alpha$$_1$PI 사이의 균형이 elastase 쪽으로 기울어지면 조직 파괴가 일어나게 된다. 본 연구자들은 이미 피부의 진피내에서 백혈구로부터 과다하게 분비되는 elastase를 저해하는 물질을 찾기 위하여, 150 여가지의 한방식물 추출물에 대해 elastase 저해활성을 스크리닝 (screening) 하여, 빈랑 (Areca catecheu) 추출물이 가장 높은 저해활성을 보여줌을 확인하였다. 본 연구에서는 유효성분을 찾기 위하여 빈랑을 90% 에탄올로 추출한 다음, 다양한 용매를 사용하여 분획하였고, 각 분획에 대해 elastase 저해활성을 측정하였다. 이 중 저해 활성이 뛰어난 분획은 silica gel 컬럼 크로마토그래피, Preparative TLC 그리고 역상 HPLC를 실시하였다. 역상 HPLC에서 elastase 저해 활성이 있는 peak은 성분을 확인할 수 있는 여러 가지 정색 반응과 UV, IR 스펙트럼을 통하여 phenol 성 물질임을 확인하였다. 빈랑으로부터 정제한 phenol 성 물질은 돼지 췌장 elastase (Porcine pancreatic elastase : PPE)와 사람 백혈구 elastase (Human neutrophil elastase ; HNE)에 대한 $IC_{50}$/ 값이 각각 26.9 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$과 60.8 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로서, 기존에 elastase의 저해제로 알려진 oleanolic acid (각각 76.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$, 219.2 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)와 ursolic acid (각각 31.0 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$, 118.6 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)에 비하여 더 우수한 저해 활성을 나타내었으며, PPE와 HNE에 대하여 기질과 경쟁적으로 반응함을 알 수 있었다. 또한 빈랑으로부터 정제한 phenol 성 물질이 염증 과정 중에 발생하는 free radical을 소거할 수 있는지를 조사한 결과, free radical을 50% 소거시키는 농도값이 6 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로 표준물질인 비타민 C (19 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)나 butylated hydroxyl toluene (18.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)보다 우수한 효과를 나타내었다. 그리고 mast cell내에서 활성화되며 hyaluronic acid를 분해하는 hyaluronidase에 대한 저해를 조사한 결과, $IC_{50}$/ 값이 210 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로서 효과적인 저해 활성을 나타내었다 따라서, 본 연구에서 빈랑으로부터 분리한 phenol 성 물질은 피부 결합 조직을 구성하는 단백질들을 보호함으로써 피부 노화를 억제하는 효과를 나타낼 것으로 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제31권10호
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• pp.913-921
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• 2021

고관절과 어깨의 점진적인 근육 약화를 특징으로 하는 지대형 근이영양증(limb-girdle muscular dystrophy: LGMD)은 우성 및 열성 유전을 모두 보여주며, TTN을 비롯한 많은 유전자가 발병과 관련된 것으로 알려져 있다. 본 연구는 40대 중반의 늦은 발병을 나타낸 상염색체 열성 LGMD 및 심방 조동의 증상을 가진 한 남성 환자의 유전적 원인을 규명하기 위해 수행되었다. 전장 엑솜 서열분석을 수행하여 환자로부터 TTN 유전자의 복합 이형 접합성 변이의 대립유전자를 동정하였다. 한 대립유전자는 [c.24124G>T (p.V8042F)]의 단일 변이를 보였지만, 다른 대립유전자는 [c.29222G>C (p.R9741P) + c.67490A>G (p.H22497R) + c.75376C>T (p.R25126C)]의 세 변이로 구성된 단상형이었다. 대립유전자 중 p.V8042F는 어머니로부터 유전된 반면, 다른 단상형 대립유전자는 아버지로부터 유전된 것으로 추정되었다. 본 연구에서 분리된 TTN 변이들은 공공 인간 유전체 데이터베이스(1,000 Genomes, gnomAD 및 KRGDB)에서 보고되지 않았거나 매우 낮은 빈도로 보고되었다. 대부분의 변이들은 고도로 보존된 면역글로불린 또는 피브로넥틴 도메인에 위치했으며, 일부 in silico 분석에 의해 병원성인 것으로 예측되었다. TTN 거대 단백질은 근육 조립, Z-라인에서 힘 전달, I-밴드에서 안정 장력 유지에 중요한 역할을 한다. 결론적으로, 우리는 이러한 이형접합성 복합 돌연변이의 이중 대립유전자가 LGMD 표현형의 유전적 원인으로서 작용할 수 있을 것으로 제시한다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제45권4호
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• pp.861-869
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• 1998

연구배경: 조식의 손상에의한 염증반응후 회복과정에서 정상조직으로 환원되지 않고 일부는 결체조직으로 대체되어 섬유화가 일어난다. 이 비정상적 섬유화에 의해 섬유화증이 일어나 조직의 원래 기능을 상설하기도 한다. 이때 염증에 관계되는 세포로부터 분비된 여러종류의 cytokine들이 섬유모세포의 증식과 교원질 합성을 조절한다. 이에 관계된 cytokine들의 상호 관련성과 섬유모세포증식에의 영향을 알아내어 조절함으로써 섬유화증을 예방하고 치료하는데 도움을 줄 수 있다. 본 연구에서는 proinflammatory cytokine인 TNF-$\alpha$, IL-1$\beta$, IL-6와 섬유모세포의 증식에 큰 영향을 미치는 TGF-$\beta$의 상호 관련성을 알아보고자 하였다. 방 법: 섬유모세포는 사람 태아의 섬유모세포주인 MRC-5를 사용하였으며, 0, 0.5, 1, 5, 10, 20%의 우태아 혈청을 첨가하여 1, 2, 3, 4, 5일째의 MRC-5 증식을 측정하여, 최소한으로 MRC-5의 증식을 억제하면서 생존을 유지시킬 수 있는 배양액중 혈청농도를 먼저 확정한 후, TGF-$\beta$, TNF-$\alpha$, IL-1$\beta$, IL-6를 각각 RPMI 배지에 첨가하여 $37^{\circ}C$, 5% $CO_2$ 보온기에서 96 시간동안 배양하여 0.5 % naphthol blue black으로 염색한 뒤, 50mM의 NaOH로 naphthol blue black을 유리시켜 630nm에서의 분광흡수를 잼으로써 MRC-5의 수를 측정하였다. 또한 TGF-$\beta$와 다른 cytokine의 관련성을 알아보기위해 TGF-$\beta$와 함께 IL-1$\beta$, IL-6, TNF-$\alpha$를 각각 배지에 첨가하여 96 시간 배양 후, 위와 동일한 방법으로 MRC-5의 수를 측정하였으며, TNF-$\alpha$와 IL-1$\beta$, IL-6의 상호 관련성을 알아보기 위해 TNF-$\alpha$와 함께 IL-1$\beta$, IL-6를 각각 배지에 첨가하여 96 시간 배양한 뒤 위와 동일한 방법으로 MRC-5의 수를 측정하였고, 마지막으로 TGF-$\beta$와 TNF-$\alpha$의 섬유모세포 증식에 미치는 상호 관련성을 알아보기 위하여 TGF-$\beta$와 TNF-$\alpha$를 함께 배지에 첨가하여 96 시간 배양 후, MRC-5의 수를 역시 통일한 방법으로 측정하였다. 결 과: 1. 최소한으로 MRC-5의 증식을 억제하면서 생존을 유지할 수 있는 배양액중 혈청 농도를 측정한 결과, 0.5% 혈청 농도에서 MRC-5의 증식이 50% 증가된 상태로 배양 6일째 까지 유지되었다. 따라서 이후의 실험에서 사용된 배양액에는 0.5%의 우태아혈청을 포함시켰다. 2. 각 cytokine이 MRC-5 증식에 미치는 영향 0.5%의 우태아혈청만이 있는 상태에서의 MRC-5 증식 정도를 100%로 기준하였을 때, IL-1$\beta$는 50 ng/ml의 농도에서만 45%의 증식 촉진효과를 보였고, IL-6는 영향이 없었으며, TGF-$\beta$와 TNF-$\alpha$는 농도에 의존성을 보이며 MRC-5의 증식을 최고 160% 까지 증가시켰다. 3. TGF-$\beta$에 의한 MRC-5 증식능증가에 IL-1$\beta$, IL-6, TNF-$\alpha$가 미치는 영향 50 ng/ml의 TGF-$\beta$ 단독 자극에 비하여, IL-1$\beta$ 혼합배양시 농도에 의존성으로 보이며 최고 64% 까지, TNF-$\alpha$ 혼합배양시 농도에 의존성을 보이며 최고 159% 까지 MRC-5의 증식을 증가시켰다. IL-6는 약한 억제효과를 보였으나 TGF-$\beta$에 의한 MRC-5 증식능 증가에 영향을 미치지 못하였다. 4. TNF-$\alpha$에 의한 MRC-5 증식능 증가에 IL-1$\beta$, IL-6가 미치는영향 50 ng/ml의 TNF-$\alpha$ 단독자극에 비하여, IL-1$\beta$을 혼합 배양하였을때 농도에 의존성을 보이며 최고 50%까지 MRC-5의 증식을 억제하였고, IL-6는 영향을 미치지 못하였다. 5. TNF-$\alpha$와 TGF-$\beta$의 MRC-5 증식능 증가에서의 상호관련성 50 ng/ml의 TGF-$\beta$와 TNF-$\alpha$는 MRC-5의 증식을 각각 89%, 135% 증가시켰으며, TGF-$\beta$와 TNF-$\alpha$ 공존시에는 MRC-5의 증식을 222% 증가시켰다. 결 론: TNF-$\alpha$ TGF-$\beta$, IL-1$\beta$의 순서로 MRC-5에 대한 증식 자극효과가 있으며 IL-6는 증식을 억제하는 효과가 있었다. TGF-$\beta$의 MRC-5에 대한 증식 자극효과는 IL-1과 TNF-$\alpha$에 의해 첨가효과를 관찰할 수 있었고, TNF-$\alpha$의 MRC-5 증식 자극효과는 IL-1$\beta$에 의하여 억제되었다.