• 생명과학회지
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• 제20권10호
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• pp.1427-1432
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• 2010

본 연구는 WSSV의 재조합단백질 rVP466에 대하여 생산된 항혈청을 사용하여 WSSV에 대한 neutralization (중화) 효과를 확인하고자 수행하였다. 먼저 재조합단백질 rVP466의 생산을 위해 WSSV의 구성단백질 VP466을 암호화하는 유전자인 VP466을 포함하는 재조합 플라스미드 pCold-VP466을 제작한 다음 이것을 발현용 숙주인 E. coli RIPL에서 발현하였다. 발현된 rVP466에 대한 항혈청은 토끼를 사용하여 생산하였으며, 항원 rVP466에 대한 특이면역반응은 Western blot을 통해 확인하였다. WSSV에 대한 항혈청의 중화효과를 확인하기 위해 항혈청과 반응시킨 바이러스액($1{\times}10^4$ 배로 희석된 WSSV)을 이용하여 실험용 새우(Penaeus chinensis)에게 주사 감염을 통해 공격실험(challenge test)을 수행하였다. 실험 결과, WSSV로 공격실험한 감염대조구(positive control)의 새우들은 감염 후 17일째에 100% 누적폐사율을 보였으며, preimmune serum과 WSSV의 혼합액을 challenge한 preimmune control의 새우들은 감염 후 25일째에 83%의 누적폐사율을 보였다. WSSV와 rVP466 항혈청을 1:0.01, 1:0.1, 1:1로 혼합한 액으로 challenge한 새우들은 감염 후 25일째에 각각 73%, 53%, 46%의 누적폐사율을 보였다. 이상의 결과를 통해 WSSV가 rVP466 항혈청에 의해 농도의존적으로 neutralization됨을 확인하였으며, 이는 WSSV 감염과정에 VP466이 관여함을 나타내는 것이다.

• 생명과학회지
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• 제13권6호
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• pp.805-813
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• 2003

돌돔 (Oplegnathus fasciatus) SL을 암호화하는 cDNA clone을 뇌하수체로부터 RT-PCR 방법에 의해 획득하였다. 돌돔 SL cDNA의 길이는 1636 bp로서 24개의 아미노산인 signal peptide와 207개 의 aa으로 구성된 mature protein을 암호화하는 696 bp의 open reading frame을 갖고 있다. 또한, 돌돔 SL 아미노산에는 이황화 결합에 관여하는 7개의 시스테인 잔기 $(Cys^{5},\; Cys^{15},\; Cys^{42},\; Cys^{65},\; Cys^{181},\; Cys^{198}\$ 과 $Cys^{206})$와 두 개의 potential N-glycosylation site인 $Asn^{121}$ 과 $Asn^{153}$을 확인하였다. 돌돔 SL은 goldfish와 channel catfish를 제외한 다른 경골어류 SL에 아미노산 서열은 61.1∼92.6%, 뉴클레오타이드 서열은 63∼92.6%의 일치를 나타낸다. 아미노산 서열 alingment에서 돌돔 SL은 다른 어류 SL에 공통적인 4개의 conserved domain $(A_{SL},\; B_{SL},\; C_{SL}$과 $D_{SL})$을 갖고 있음을 확인하였다. 이들중 $A_{SL},\; B_{SL}$,과 $D_{SL}$,은 경골어류 growth hormone과 prolactin에도 잘 보존되어 있었다 재조합 돌돔 SL 단백질을 E. coli에서 생산하기 위해 돌돔 SL cDNA를 발현벡터에 클로닝하여 단백질의 발현을 유도하였다 발현된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분자량 약 27 kDa의 재조합 단백질의 발현을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제28권12호
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• pp.1416-1423
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• 2018

Biotin에 강한 결합 친화력($K_D=10^{-14}M$)과 함께 streptavidin의 tetramer 특징은 VHH 항체를 streptavidin에 융합시키게 하여 biotinylated horseradish peroxidase를 사용하는ELISA 와Western blot analysis 등의 면역분석법에서 VHH 항체의 항원결합력을 증가시키는데 응용 가능하다. 이를 응용하기 위해 우리는 Streptomyces avidinii 염색체 DNA로부터 PCR을 통해 streptavidin유전자를 증폭하고 이를 green fluorescent protein항원에 특이적으로 결합하는 8B9 VHH 항체유전자에 융합시켰다. 대장균에서 수용성 융합단백질로 발현시키기 위해 pUC119 플라스미드에 기초한 발현시스템을 사용하였다. 즉 lacZ promoter를 사용하여 IPTG에 의해 단백질발현을 유도하게 하였으며, 아미노말단에 pelB leader를 두어 발현된 단백질의 periplasmic space로 이동하게 하여 수용성 단백질형태의 분비를 촉진하였으며 카르복시말단에 6개의 polyhistidine tags를 두어 $Ni^+$-NTA-agarose column을 사용하여 발현된 단백질을 정제하였다. Streptavidin이 biotin에 강하게 결합함으로 대장균에 독성을 나타냄에도 불구하고 본 수용성 융합단백질은 성공적으로 발현되었다. SDS-PAGE에서 가열하는 경우 변성되어 30.6 kDa를, 가열하지 않는 경우에는 자연 상태의 122.4 kDa을 나타내었다. 이는 8B9 VHH항체에 융합된 streptavidin moiety에 의해 monomer subunit가 비공유결합으로 tetramerization됨을 제시해준다. 또한 본 융합단백질은 ELISA와 Westernblot analysis에서 보여진 것처럼 parental streptavidin과 유사한 biotin결합력과 green fluorescent protein항원 결합력을 모두 나타내었다. 결론적으로 streptavidin에 융합된 8B9 VHH 항체형태의 융합단백질은 대장균에서 수용성 tetramer로 성공적으로 발현 및 정제되었으며 biotin과 green fluorescent protein 항원에 동시에 결합함으로써 tetrameric and bifunctional VHH 항체제조의 가능성을 제시해주었다.

• 한국수산과학회지
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• 제20권1호
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• pp.57-62
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• 1987

온도감수성 대장균 M5248 균주에 있어서의 plasmid $pPL-\lambda$와 pAS1을 $30^{\circ}C$에서 형질전환 시킬 때의 조건을 조사한 바 배양시간에 있어서는 균주의 대수 증식기 중반인 2시간 30분 배양시, 즉 cell농도는 $4.5\times10^7\;cells/ml$이며 파장 590nm에서의 흡광도가 0.45 일 때 plasmid $pPL-\lambda$와 pAS1 모두 형질전환율은 $2.4\times10^6$과 $1.5\times10^{-6}$로서 가장 높았다. 그리 고 competent cell $200{\mu}l(9\times10^{-6}cell)$에 대하여 plasmid 농도가 $6.4{\mu}g/ml$ 형질전환율이 $4.4\times10^{-6}$로서 높게 나타났으며 이때 calcium chloride만으로 처리한 것 보다 calcium chloride와 thymidine을 혼합하여 처리했을 때 2배 정도 더 많은 transformant를 유도하였다. Ampicillin 내성유전자는 LB배지를 첨가하여 $30^{\circ}C$에서 2시간 동안 배양했을 때 그 형질이 표현되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제27권7호
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• pp.1216-1222
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• 2017

To develop starters for the production of functional foods or materials, lactic acid bacteria producing ${\gamma}-aminobutyric$ acid (GABA) were screened from jeotgals, Korean fermented seafoods. One isolate producing a high amount of GABA from monosodium $\text\tiny{L}$-glutamate (MSG) was identified as Enterococcus avium by 16S rRNA gene sequencing. E. avium M5 produced $18.47{\pm}1.26mg/ml$ GABA when incubated for 48 h at $37^{\circ}C$ in MRS broth with MSG (3% (w/v)). A gadB gene encoding glutamate decarboxylase (GAD) was cloned and overexpressed in E. coli BL21 (DE3) using the pET26b (+) expression vector. Recombinant GAD was purified through a Ni-NTA column and the size was estimated to be 53 kDa by SDS-PAGE. Maximum GAD activity was observed at pH 4.5 and $55^{\circ}C$and the activity was dependent on pyridoxal 5'-phosphate. The $K_m$ and $V_{max}$ values of GAD were $3.26{\pm}0.21mM$ and $0.0120{\pm}0.0001mM/min$, respectively, when MSG was used as a substrate. Enterococcus avium M5 secretes a lot of GABA when grown on MRS with MSG, and the strain is useful for the production of fermented foods containing a high amount of GABA.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제23권4호
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• pp.545-554
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• 2013

Plasmid isolation of kimchi-derived Weissella cibaria KLC140 revealed six different plasmids. The smallest plasmid, pKW2124, was DNA sequenced and characterized, showing 2,126 bp with a GC content of 36.39% and five putative open reading frames (ORFs). In silico analysis of these ORFs showed ORF1 encodes a putative replication protein similar to rolling circular replication proteins from other lactic acid bacteria. However, a single-stranded intermediate was not detected when S1 nuclease was treated, suggesting it may follow theta replication. Interestingly, the replication initiation site of this plasmid is 100% identical to other plasmids from lactic acid bacteria, suggesting it may function for replication initiation. To construct a surface layer expression vector, pTSLGFP, slpA encoding the surface layer protein from Lactobacillus acidophilus was PCR amplified and fused with the gfp gene, forming a SLGFP fused gene. The plasmid pKW2124 was cloned into the XbaI site of pUC19, forming an Weissella-E. coli shuttle vector pKUW22. NheI-linearized pTSLGFP was ligated into pKUWCAT containing pKUW22 and the chloramphenicol acetyltransferase gene from pEK104, resulting in an 8.6 kb pKWCSLGFP surface layer expression vector. After transformation of this vector into W. cibaria KLC140, a GFP fluorescence signal was detected on the surface of the transformant, substantiating production of SLGFP fused protein and its secretion. This is the first report for construction of a Weissella surface layer expression vector, which may be useful for surface layer production of beneficial proteins in Weissella.

• 대한의생명과학회지
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• 제4권1호
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• pp.1-9
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• 1998

효모의 티올특이성 항산화단백과 아미노산 서열상 상동성을 보이는 50종류의 단백은 새로운 항산화 단백군을 형성하며 또한 병원성 미생물에도 널리 분포하고 있으나 이들 단백의 생화학적 및 생리적인 기능은 거의 알려져 있지 않은 실정이다. 본 연구는 병원성 미생물의 티올특이성 항산화단백의 기능에 관한 연구로서 Saccharomyces cerevisiae의 TSA 및 Salmonella typhimurium alkcyl hydroperoxide reductase의 AhpC subunit와 상동성을 나타내는 Corynebacterium diphtheriae의 DirA 유전자를 PCR 방법으로 클로닝하고 대장균에 발현시킨 후 정제하여 항산화 특성을 조사하였다. 정제된 DirA는 티올을 함유하는 금속촉매 산화계인 DTT/Fe$^{3+}$를 선택적으로 억제하였으며 티오레독신 의존성 과산화물 분해활성을 나타내었다. DTT/Fe$^{3+}$ 금속촉매 산화계에 의한 효소의 불활성화를 50% 억제 하는 DirA의 농도는 0.12 mg/ml로 효모 TSA 항산화활성의 약1/4 수준이었으며, 효모의 티 오레 독신계와 반응시켰을때 과산화물 분해활성은 0.02 unit/mg로서 효모 TSA의 티오레독신 의존성 과산화물 분해활성의 1/20수준이었다. 정제된 단백질을 이용하여 항체를 제조하였으며 이항체를 이용하여 Corynebacterium diphtheriae에서 발현됨을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 Corynebacterium diphtheriae의 병원성은 숙주세포의 방어기전인 백혈구에 의하여 생성되는 과산화수소 또는 다른 활성산소종을 제거하는 DirA작용과 연관이 있는 것으로 사료된다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제54권2호
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• pp.94-100
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• 2011

Bacillus licheniformis로 부터 phospholipase D (PLD)로 추정되는 유전자를 PCR 기술을 이용하여 분리하여 pGEM-T easy 운반체에 cloning 하였다. 분리된 유전자는 His6가 붙은 pET-21 운반체를 이용하여 E. coli BL21 (DE3)에서 발현시켰다. 재 조합된 PLD는 nikel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin을 갖는 column을 이용하여 affinity chromatography로 분리하였다. SDS-PAGE 분석 결과 PLD로 추정되는 단백질은 약 44 kDa의 주요 단일밴드를 나타내었다. 분리된 효소의 최적 활성도는 pH 7.0에서 나타났으며 이 조건에서 또한 효소가 제일 안정되었다. 효소활성에 미치는 최적 온도는 $40-45^{\circ}C$의 온도에서 형성되어 비교적 높은 온도를 나타내었으며 비교적 넓은 범위의 온도에서 상당히 높은 효소 활성도를 나타내었다. 여러 가지 detergent 중에서 Triton X-100을 0.6 mM까지 첨가할 경우 PLD의 효소활성도는 점진적으로 증가하여 대조구 대비 최대 181%의 효소 활성도를 나타내었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제41권4호
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• pp.391-397
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• 2013

본 연구에서 584개의 아미노산(68.7 kDa)으로 구성된 cyclomaltodextrinase (LLCD)의 유전자를 Lactococcus lactis subsp. lactis KCTC 3769 (ATCC 19435)로부터 클로닝하였다. LLCD는 일반적인 CDase 계열 효소들과 약 40% 전후의 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. C-말단에 6개의 히스티딘 잔기를 가진 재조합 효소는 dimer의 형태로 대장균에서 발현되고 정제되었다. LLCD는 pH 7.0 및 $37^{\circ}C$에서 최대의 ${\beta}$-CD 가수분해 활성을 나타내었다. 특히, 이 효소는 starch 및 pullulan에 대해 극히 낮은 활성을 보였으나, 반면에 CD에 대한 가수분해 활성은 starch에 비해 약 80배 이상 높았다. 이처럼 높은 CD에 대한 활성을 근거로 LLCD는 CDase 계열 효소로 분류될 수 있으나, starch, pullulan, 그리고 acarbose에 대한 매우 낮은 활성은 다른 유사효소와 비교하여 차별화되는 특징이다.

• 농업생명과학연구
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• 제45권6호
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• pp.201-212
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• 2011

인천 연안의 심하게 오염된 갯벌로부터 강력한 세포외 알카리성 단백질 분해효소를 생산하는 호알카리성 Bacillus clausii I-52를 분리하였으며, 이 균주로부터 알카리성 단백질 분해효소의 유전자를 cloning하여 서열 분석을 하였다. Chromosome 서열이 완전히 밝혀진 Bacillus subtilis의 서열을 기초로 하여 알카리성 단백질 분해효소 및 promoter를 포함하도록 primer를 고안하여 PCR을 수행하여 2,277 bp의 DNA 단편을 얻었으며 BLAST 분석 결과 29 개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide, 77 개의 아미노산으로 이루어진 propeptide 및 275 개의 아미노산을 갖는 활성형의 BCAP으로 구성된 총 381 개의 아미노산을 코딩하는 1,143 bp의 open reading frame을 확인하였다. 활성형 BCAP의 N-말단 아미노산은 Ala이며, 분자량 및 pI 값은 각각 27698.7 Da과 6.30으로 계산되었다. 아미노산 상동성을 분석한 결과, B. subtilis 유래의 nattokinase precursor 및 B. subtilis BSn5 유래의 subtilisin E precursor와 99%의 서열 상동성을 나타내어 B. clausii I-52 유래의 BCAP은 subtilisin 계열의 단백질 분해효소임을 확인하였다. E. coli BL21(DE3)에서 발현한 재조합 BCAP는 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 를 효율적으로 분해하였다. Refolding한 재조합 BCAP은 전형적인 serine protease inhibitor인 PMSF에 의하여 강하게 효소 활성이 억제됨으로써 serine protease 계열의 단백질 분해효소임을 알 수 있었다.