• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제32권9호
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• pp.1178-1185
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• 2022

Steroids are a class of compounds with cyclopentane polyhydrophenanthrene as the parent nucleus, and they usually have unique biological and pharmacological activities. Most of the biosynthesis of steroids is completed by a series of enzymatic reactions starting from cholesterol. Synthetic biology can be used to synthesize cholesterol in engineered microorganisms, but the production of cholesterol is too low to further produce other high-value steroids from cholesterol as the raw material and precursor. In this work, combinational strategies were established to increase the production of cholesterol in engineered Saccharomyces cerevisiae RH6829. The basic medium for high cholesterol production was selected by screening 8 kinds of culture media. Single-factor optimization of the carbon and nitrogen sources of the culture medium, and the addition of calcium ions, zinc ions and citric acid, further increased the cholesterol production to 192.53 mg/l. In the 5-L bioreactor, through the establishment of strategies for glucose and citric acid feeding and dissolved oxygen regulation, the cholesterol production was further increased to 339.87 mg/l, which was 734% higher than that in the original medium. This is the highest titer of cholesterol produced by microorganisms currently reported. The fermentation program has also been conducted in a 50-L bioreactor to prove its stability and feasibility.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제29권3호
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• pp.339-346
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• 2019

L-Arabinose, a five carbon sugar, has not been considered as an important bioresource because most studies have focused on D-xylose, another type of five-carbon sugar that is prevalent as a monomeric structure of hemicellulose. In fact, L-arabinose is also an important monomer of hemicellulose, but its content is much more significant in pectin (3-22%, g/g pectin), which is considered an alternative biomass due to its low lignin content and mass production as juice-processing waste. This review presents native and engineered microorganisms that can ferment L-arabinose. Saccharomyces cerevisiae is highlighted as the most preferred engineering host for expressing a heterologous arabinose pathway for producing ethanol. Because metabolic engineering efforts have been limited so far, with this review as momentum, more attention to research is needed on the fermentation of L-arabinose as well as the utilization of pectin-rich biomass.

• 한국지하수토양환경학회:학술대회논문집
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• 한국지하수토양환경학회 2004년도 임시총회 및 추계학술발표회
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• pp.290-292
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• 2004

Heavy metal contamination has been increased in aqueous environments near many industrial facilities, such as metal plating facilities, mining operations, and tanneries. The soils in the vicinity of many military bases are also reported to be contaminated and pose a risk of groundwater and surface water contamination with heavy metals. The biological removal of metals through bioaccumulation has distinct advantages over conventional methods; the process rarely produces undesirable or deleterious chemical byproducts, it is highly efficient, easy to operate and cost-effective in the treatment of large volumes of wastewater containing toxic heavy metals. In addition, a recent development of molecular biology shed light on the enhancing the microorganism's natural remediation capability as well as improving the current biological treatment. In this study, characteristics of the cell growth and heavy metal accumulation by Saccharomyces cerevisiae strains expressing phytochelatin syntahse (PCS) gene were studied in batch cultures. The AtCRFI gene was demonstrated to confer substantial increases in metal tolerance in yeast. PCS-expressing cells tolerated more Cd$^{2＋}$ than controls.

• 생명과학회지
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• 제15권1호
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• pp.118-123
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• 2005

B. stearothermophilus 유래의 CGTase 유전자(cgtS)를 보유하고 있는 재조합 plasmid pCGTS (4.8 kb)을 효모 표면 발현용 vector인 pYDl (GAL1 promoter)에 subcloning 하였다. 구축된 재조합 plasmid, pYDCGT (7.2 kb)는 S. cerevisiae EBY100에 형질전환하였고, tryptophan이 결여된 SD 배지에서 1차 선별된 형질전환체들을 YPGS배지에서 배양 후 활성 염색을 통하여 CD가 생 성 됨을 확인하였다. 배양시간과 효소반응시간에 따른 반응 산물을 TLC로 분석 한 결과, 배양 12시간째부터 효소활성이 나타났고, 반응 10분 이후부터 CD가 생성되어 시간이 지남에 따라 CD 생성양이 증가하는 것을 확인하였다. 회분 배양한 결과 $25^{\circ}C$와 $30^{\circ}C$에서 CGTase의 최대 활성이 각각 21.3 unit/1 와 16.5 unit/1로 나타났고, plasmid 안정성은 각각 $86\%$와 $82\%$로 나타나 배양온도에 상관없이 plasmid는 비교적 안정하게 유지되었다.

• KSBB Journal
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• 제19권6호
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• pp.441-445
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• 2004

본 연구에서는 사람 ferritin H- 및 L-chain 유전자가 재조합된 효모 S. cerevisiae에 있어서 철의 생체 흡수 반응을 수행하였다. 재조합 효모는 $2\%$ galactose가 첨가된 YEP 배지에서 3일간 batch culture한 후, 20 mM MOPS buffer (pH 6.5) 에서 반응 균체 농도, 철 화합물 종류, 철 농도, 및 반응 시간 등을 고려하여 반응을 진행하였다. 이 실험 결과, ferritin H-chain 유전자를 발현하는 균주 YGH2에 있어서 균체 농도 100 mg/ml에서 균체 농도 200 mg/ml보다 높은 철 농도를 보였다. 그리고, 철 흡수 반응에 있어서 Fe(II)의 산화 상태가Fe(III)보다 훨씬 유리하였다. 철 농도의 증가에 따라 철 흡수량도 증가하였으며, 14.3 mM Fe(II)과 반응시 YGH2의 세포내 철 농도는 $16.7{\pm}0.7\;{\mu}mol/g$ cell wet wt.로 분석되었다. 철 흡수는 반응 시작 후 약 120분 경에 거의 최대치에 이르렀다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제26권3호
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• pp.498-502
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• 2016

3'-Hydroxygenistein can be obtained from the biotransformation of genistein by the engineered Pichia pastoris X-33 strain, which harbors a fusion gene composed of CYP57B3 from Aspergillus oryzae and a cytochrome P450 oxidoreductase gene (sCPR) from Saccharomyces cerevisiae. P. pastoris X-33 mutants with higher 3'-hydroxygenistein production were selected using a periodic hydrogen peroxide-shocking strategy. One mutant (P2-D14-5) produced 23.0 mg/l of 3'-hydroxygenistein, representing 1.87-fold more than that produced by the recombinant X-33. When using a 5 L fermenter, the P2-D14-5 mutant produced 20.3 mg/l of 3'-hydroxygenistein, indicating a high potential for industrial-scale 3'-hydroxygenistein production.

• 한국미생물생명공학회:학술대회논문집
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• 한국미생물생명공학회 2004년도 Annual Meeting BioExibition International Symposium
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• pp.278-281
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• 2004

The $\alpha$1,6-mannosyltransferase encoded by Saccharomyces cerevisiae OCH1 plays a key role for the outer chain initiation of the N-linked oligosaccharides. A search for Hansenula polymorpha genes homologous to S. cerevisiae OCHI (ScOCH1) has revealed seven open reading frames (ORF100, ORF142, ORF168, ORF288, ORF379, ORF576, ORF580). All of the seven ORFs are predicted to be a type II integral membrane protein containing a transmembrane domain near the amino-terminal region and has a DXD motif, which has been found in the active site of many glycosyltransferases. Among this seven-membered OCH1 gene family of H. polymorpha, we have carried out a functional analysis of H. polymorpha ORF168 (HpOCH2) showing the highest identity to ScOCH1. Inactivation of this protein by disruption of corresponding gene resulted in several phenotypes suggestive of cell wall defects, including hypersensitivity to hygromycin B and sodium deoxycholate. The structural analysis of N-glycans synthesized in HpOCH2-disrupted strain (Hpoch2Δ) and the in vitro $\alpha$1,6-mannosyltransferase activity assay strongly indicate that HpOch2p is a key enzyme adding the first $\alpha$1,6-mannose residue on the core glycan Man$_{8}$GlcNAc$_2$. The Hpoch2Δ was further genetically engineered to synthesize a recombinant glycoprotein with the human compatible N-linked oligosaccharide, Man$_{5}$GlcNAc$_2$, by overexpression of the Aspergillus saitoi $\alpha$1,2-mannosidase with the 'HDEL” ER retention signal.gnal.

• 미생물학회지
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• 제50권1호
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• pp.1-7
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• 2014

생명체에서 비천연 아미노산을 단백질의 특정 위치에 삽입하는 방법으로 orthogonal suppressor tRNA와 여기에 비천연 아미노산을 특이적으로 결합시킬 수 있는 유전자 변형된 aminoacyl-tRNA synthetase (ARS)가 활용되고 있다. 이 기술개발을 위해서는 돌연변이를 유발한 ARS library로부터 비천연 아미노산만을 특이적으로 결합시킬 수 있는 변형된 ARS를 탐색하기 위한 선별시스템이 필요하다. 본 논문에서는 대장균에서 작용하는 2단계로 구성된 새로운 선별시스템을 개발하였다. 먼저 양성선별 시스템은 27번 잔기를 amber 코돈으로 치환한 Chloramphenicol acetyl transferase 유전자로 구성되어 있으며, 이유전자의 amber suppression에 의해 chloramphenicol 배지에서 생존함에 따라 활성을 나타내는 ARS를 최고 $9.0{\times}10^5$배로 농축할 수 있었다. 반면 음성선별 시스템은 대장균의 Topoisomerase II의 기능을 억제하는 단백질을 암호화하는 control of cell death B (ccdB) 유전자의 N-말단 앞에 3개의 amber 코돈을 삽입하여 제작하였다. 이 음성선별 시스템을 가진 대장균에 orthogonal pair인 Saccharomyces cerevisiae tyrosyl-tRNA synthetase (Scc TyrRS)와 amber suppressor tRNA를 형질전환하면 amber suppression으로 CcdB가 발현되어 대장균의 성장이 억제되는 것을 확인하였으며, 천연 아미노산에 대한 특이성을 가진 ARS를 효과적으로 제거하는 것을 관찰하였다. 따라서, 양성선별 및 음성선별 시스템을 순차적으로 거침으로써 무작위적으로 아미노산에 대한 특이성을 변형시킨 ARS 라이브러리로부터 비천연 아미노산을 suppressor tRNA에 특이적으로 결합하는 유전자 변형 ARS를 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

• 미생물학회지
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• 제54권4호
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• pp.420-427
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• 2018

효모균 타이로실-tRNA 합성효소(Sc YRS)와 엠버 멈춤코돈을 인식하는 대장균 시작tRNA 변이체(fMam $tRNA_{CUA}$)쌍은 대장균에서 단백질 생합성시 원하는 특정 위치에 비천연아미노산을 도입하는데 활용된다. Sc YRS/fMam $tRNA_{CUA}$쌍의 엠버써프레션 활성을 높이기 위해 fMam $tRNA_{CUA}$의 첫번째 안티코돈 염기를 인식하는 Sc YRS의 320번, 321번 아미노산 잔기를 암호화하는 염기서열을 무작위로 돌연변이시킨 라이브러리를 제작하였다. 엠버써프레션에 의한 클로람페니콜 저항성을 이용해 라이브러리를 탐색하여 활성이 향상된 2개의 돌연변이주를 선별하였다. 이들의 클로람페니콜 저항성 성장의 $IC_{50}$값은 야생형 YRS보다 1.7~2.3배 높았으며, in vivo 엠버써프레션 활성을 비교한 결과 3~6.5배의 활성 증가가 나타났다. 높은 활성을 보인 mYRS-3 (P320A/D321A) 단백질의 fMam $tRNA_{CUA}$에 대한 in vitro aminoacylation kinetics 분석은 야생형보다 약 7배 높은 효소활성을 보였으며, 이는 주로 기질인 fMam $tRNA_{CUA}$에 대한 결합 친화도가 증가하여 나타났다. 이런 접근법을 이용하여 다양한 종류의 비천연 아미노산 도입에 활용되는 aminoacyl-tRNA 합성효소의 엠버써프레션 활성을 높임으로써 엠버 멈춤코돈을 이용한 비천연 아미노산 도입 효율성을 높일 수 있을 것이다.

• 미생물학회지
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• 제45권2호
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• pp.215-221
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• 2009

대장균에서 비천연 아미노산을 단백질 생합성시 특정 위치에 삽입하는 방법의 하나로 amber suppressor tRNA와 여기에 비천연 아미노산을 특이적으로 결합할 수 있는 변형된 aminoacyl-tRNA synthetase 쌍을 이용한다. 이러한 기술의 개발을 위해 필요한 여러 요소 중 하나는 이러한 시스템이 대장균에서 얼마나 잘 작동하는지를 확인할 수 있는 in vivo 보고시스템을 설정하는 것이다. 본 논문에서는 $\beta$-galactosidase 유전자의 N-말단에 amber 코돈을 삽입한 보고유전자를 제작하였으며, 이를 대장균(DH10B)의 chromosomal DNA에 삽입하여 DH10B(Tn:lacZam) 균주를 개발하였다. Genomic PCR과 Southern blot 분석을 통하여 lacZ amber 유전자가 대장균의 염색체에 삽입된 것을 확인하였으며, DH10B(Tn:lacZam)은 amber suppression을 유도할 수 있는 벡터가 형질 전환될 경우만 $\beta$-galactosidase 활성을 나타냈다. DH10B(Tn:lacZam)에 효모균의 amber suppressor $tRNA^{Tyr}$와 Tyrosyl-tRNA synthetase 쌍을 동시에 발현하는 벡터를 형질전환하였을 때, amber suppression에 의해서 $\beta$-galactosidase 활성이 나타났다. 하지만 이 활성은 대장균의 amber suppressor $tRNA^{Gln}$를 발현하는 pSupE2를 형질전환하였을 때와 비교 하여 매우 낮은 $\beta$-galactosidase 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 DH10B(Tn:lacZam) 균주가 $\beta$-galactosidase 활성을 통하여 정성 및 정량적으로 in vivo amber suppression 활성을 비교 분석할 수 있는 특성을 가졌음을 나타낸다.