Ganoderma lucidum이 생산하는 polygalacturonase의 유용활용 방안을 위한 효소의 특성을 연구하기 위하여 버섯배양물로부터 효소를 생산하고 정제하여 그 특성을 검토한 결과는 다음과 같다. Endo-polygalacturonase는 배양여액으로부터 ammonium sulfate 침전, Biogel P-100, DEAE-cellulose, Sehpadex G-150 column chromatography에 의하여 순차적으로 정제되었고, Sehpadex G-150 column chromatography에서 re-gel filtration까지 실시한 결과 specific activity가 892unit/mg protein로 배양여액보다도 약 56배의 정제도를 나타냈으며, exo-polygalacturonase는 ammonium sulfate침전, Biogel P-100, DEAE-cellulose column chromatography까지 부분정제한 결과 9.2배의 정제도를 나타냈다. SDS polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시한 결과 단일 band를 나타냈으며, 분자량은 54,000 dalton이었다. Endo-polygalacturonase와 exo-polygalacturonase는 citrus pectin이나 pectic acid보다 apple pectin에 친화도가 높았으며, Lineweaver-Burk plot로부터 계산된 apple pectin에 대한 Km 치는 각각 1.44와 10.6 mg/ml이었다. 이 두 효소의 작용 최적 pH는 4.0이었으나 pH 안정성에서는 endo-polygalacturonase는 $pH\;4.0{\sim}6.0$에서, exo-polygalacturonase는 $pH\;3.5{\sim}5.5$ 범위에서 안정하였다. 효소반응 최적 온도는 endo-polygalacturonase는 $40^{\circ}C$ 이었으나 exo-polygalacturonase는 $60^{\circ}C$에서 최대의 활성을 나타냈고 열안정성도 exo-polygalacturonase가 endo-polygalacturonase보다 더 높은 온도에서도 안정하였다. 또한 endo-polygalacturonase는 $Ca^{++}$ 과 $Mn^{++}\;ion$에, exo-polygalacturonase에는 $Ca^{++}\;ion$에 의해 효소반응이 촉진되었다.
Ganoderma lucidum이 생산하는 polygalacturoanse(endo- 및 exo-polygalacturoanse)를 이용하여 과즙청징 효과를 검토한 결과에 endo-polygalacturoanse에 의해서만 과즙청징을 이를 수 있었으며, 과즙청징을 위한 endo-polygalacturoanse의 반응 최적 온도는 $40^{\circ}C$이었고, 과즙 5 ml 당 약 4 unit의 endo-polygalacturoanse를 첨가 하였을 때 60분에 거의 청징되었다. 그리고 polygalacturoanse의 효소원으로는 영지버섯 균사체 배양 여액이나 ammonium sulfate 분획물을 이용하는 방안이 가장 효율적일 것으로 생각되었다.
Aspergillus niger sherumanni IAM 2059가 분비하는 펙틴질분해효소 중에서 endo-polygalacturonase 를 Sephadex G-100, DEAE-Sephadex A-50을 이용하여 분리하고 점도감소와 분해산물분석을 통해 효소의 특성을 조사하였다. Chromatography를 통해 얻은 3 개의 역가 fraction (F-A, F-I 및 F-II) 은 각각 exo형 효소, eodo-polygalacturonase, endo-polymethylgalacturonase 이었다. endo-polygalacturonase의 역가 최적 pH는 환원당 생성으로는 pH4.2 근방이었고 점도감도로는 pH4.7 근방이었다. 이 효소의 Z-value는 $7.5^{\circ}C$이고 $D40^{\circ}C$는 240sec 이며 $40^{\circ}C$에서 활성화엔트로피(Enthalphy of activation) 217.3KJ/mol, 활성화엔트로피(Entropy of activation) 409.2J/mol.K, 활성화자유에너지(Free energy activation) 89.2KJ/mol 이었다.
사과푸른곰팡이병균 Penicillium expansum의 benomyl 저항성균주(抵抗性菌株) 중(中) 병원성이 약화된 균주를 선발하여 pectin질(質) 분해효소(分解酵素)의 활성과 병원성(病原性)간의 관계를 알아보았다. 인공배지에서는 병원성이 높은 $S_2$균주와 병원성이 낮은 $R_2$균주가 endo-polymethylgalacturonase, endo-polygalacturonase, pectin methyl-trans-eliminase, polygalacturonate-trans-eliminase를 생산하였으며 두균주간의 효소활성에 있어서 현저한 차이는 없었다. 사과배지에서는 위의 4개의 효소가 모두 생산되었으나 endo-polymethylgalacturonsae, endo-polygalacturonase의 활성은 병원성이 높은 $S_1$균주가 병원성이 낮은 $R_2$균주보다 6배 이상 높은 활성을 보였으나 pectin methyl-trans-eliminase와 polygalacturonate-trans-eliminase의 활성은 큰 차이가 없었다. Ammonium sulfate로 염석시켜 얻어진 조효소액(粗酵素液) 중(中) $80{\sim}90%$ fraction에서 endo-PMG와 endo-PG의 활성이 가장 높았으며 이 조효소액(粗酵素液)의 첨가(添加)에 따른 저항성균주(抵抗性菌株)의 병원성이 대조구에 비하여 증가하였다.
한국산 대추로부터 조직의 연화에 작용하는 endo-polygalacturonase를 gel filtration과 이온교환크로마토그라피에 의하여 단일 단백질로 정제할 수 있었고, 수율은 약 6% 정도였다. 정제된 이 효소는 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis에 의하여 분자량이 약 19,000정도의 monomer로 확인되었고, 결정구조는 육각판상 모양을 나타내었다.
한국산 토마토로부터 endo-polygalacturonase를 gel filtration과 이온교환크로마토그라피에 의하여 약 24배 정제할 수 있었고, 최대 효소활성을 위한 PH는 5.0, 최적온도는 $50^{\circ}C$ 였으며 pH안정범위는 $4.0{\sim}5.0$, 열안정성은 $50^{\circ}C$에서 1시간 열처리 하였을 때 약 45 % 실활 되었다. 정제된 이 효소는 SDS-polyacrylamide gel 전기영동에 의하여 단일밴드로 확인되었으며, 그 분자량은 50,000정도였고, Km값은 $1.43{\times}10^{-1}\;mol/l이었다. 금속이온중 $Ag^+$, $Zn^{++}$이온이 효소의 활성을 촉진시켰으며, $Na^+$, $K^+$등의 이온에 의해서는 활성이 저해되었다.
An endo-polygalacturonase (endo-PGase) exhibiting excellent performance during acidic fruit juice production would be highly attractive to the fruit juice industry. However, candidate endo-PGases for this purpose have rarely been reported. In this study, we expressed a gene from Penicillium oxalicum in Pichia pastoris. The recombinant enzyme PoxaEnPG28C had an optimal enzyme activity at pH 4.5 and 45℃ and was stable at pH 3.0-6.5 and < 45℃. The enzyme had a specific activity of 4,377.65 ± 55.37 U/mg towards polygalacturonic acid, and the Km and Vmax values of PoxaEnPG28C were calculated as 1.64 g/l and 6127.45 U/mg, respectively. PoxaEnPG28C increased the light transmittance of orange, lemon, strawberry and hawthorn juice by 13.9 ± 0.3%, 29.4 ± 3.8%, 95.7 ± 10.2% and 79.8 ± 1.7%, respectively; it reduced the viscosity of the same juices by 25.7 ± 1.6%, 52.0 ± 4.5%, 48.2 ± 0.7% and 80.5 ± 2.3%, respectively, and it increased the yield of the juices by 24.5 ± 0.7%, 12.7 ± 2.2%, 48.5 ± 4.2% and 104.5 ± 6.4%, respectively. Thus, PoxaEnPG28C could be considered an excellent candidate enzyme for acidic fruit juice production. Remarkably, fruit juice production using hawthorn as an material was reported for the first time.
인삼뿌리썩음병균, Cylindrocarpon destructans(Zins.) Scholten을 접종한 인삼절편으로 부터 얻은 섬유소분해효소 및 펙틴질분해광소의 역가는 그 농도, 시간에 비례하였다. Cellulase (Cx), endo-polygalacturonase(endo-PG), endo-poiymethylgalacturonase (endo-PMG), exo-polygalacturonase (exe-PG)와 exo-polymeth-ylgalacturonase(exo-PMG)의 역가는 접종후 4 일째 최대였으며 endo-PG와 endo-PMG는 1일 및 2일째는 전혀 검출되지 않았으나 exo-PG와 exo-PMG는 검출되었다. 접종후 6 일째에는 모든 펙틴질분해효소는 활성을 완전히 잃었으나 섬유소분해효소는 높은 역가을 유지하였다. Cx, endo-PG, endo-PMG, exo-PG 및 exo-PMG의 최적 pH는 각각 6.0, 5.5, 8.0, 7.0-7.5, 8.5이였다. Cx, endo-PG, endo-PMG, 및 exo-PG의 최적온도는 각각 exo-PMG $66^{\circ}C\;53^{\circ}C\;41^{\circ}C\;37^{\circ}C\;and\;40^{\circ}C$였다. 섬유소분해효소는 공시한 16개 이온중에서 0.05M $Hg^{++}$만이 억제하였다. 펙틴질분해효소는 이온에 따라 상이하였으나 $0.05M\; Fe^{+++}$과 $0.05M\;Al^{+++}$이 가장 현저히 억제하였다. 공시한 8개 농약중에서 어느 것도 $0.1\%$ 유효성분으로는 모든 효소작용을 억제하지 못했으며 exo-PG만은 모든 농약의 의하여 상당히 억제되었다. 그 중에서 Difolatan은 모든 펙틴질분해효소를 가장 잘 억제시켰다. $0.2M\;Ca^{++}$과 $0.02M\;Fe^{+++}$은 펙틴질분해효소를 거의 억제시켰으나 섬유소분해효소는 같은 농도에서 각각 $30\%,\;70\%$에 이르렀다. Formalin은 exo-PG와 endo-PMG를 완전 억제시켰으나 다른 효소 특히 Cx는 그렇지 못했다. $0.8\%$ Difolatan은 모든 효소를 $0.8\%$이상 억제하였으나 Cx는 그 이하였다. C. destructans가 분필하는 섬유소분해효소 및 펙틴질분해효소는 인삼뿌리썩음병과 밀접한 관계를 가지고 있으며 이 병을 효과적으로 방제하기 위하여 억제되어야 하겠다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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