Extrusion시켜 구조변형시킨 전분(질)을 기질로 cyclodextrin glucanotransferse(CGTase)를 활용하여 액화과정을 거치지 않고 직접 cyclodextrin을 합성하는 불용성 extrusion된 전분-수용성 CGTase로 구성된 불균일상 효소반응계에 관하여 연구하였다. Extrusion된 전분을 기질로 이용할 경우 기존의 액화전분을 기질로하는 균일상 효소반응계에서 보다 현저히 증가된 CD 농도, 수율 그리고 합성속도를 얻을 수 있었으며, extrusion된 전분 기질농도가 100g/l일 때 CD생성량과 수율은 각각 54g/l와 0.54였다.
AA를 AA-2G로 전환하는 CGTase를 고정화하여 AA-2G 대량 생산의 가능성을 고찰한 결과, CNBr-sepharose 4B가 가장 효과적인 담체로 판명되었고, CGTase의 고정화 최적 조건과 고정화 CGTase에 의한 AA-2G 생산의 최적조건 및 재사용성을 검토하였다. 최적 고정화 조건은 효소량 24,000 units/g resin으로 9시간 반응하여 약 18,000 units/g resin의 최고 고정화율을 얻을 수 있으며, pH 5.0(50 mM sodium citrate buffer)용액에 12% AA-Na와 8% soluble starch를 기질로 하여 800 units/ml의 고정화 CGTase를 첨가한 후 $37^{\circ}C$에서 100 rpm으로 교반하면서 25시간 반응하여 약 18 mM의 AA-2G 최고량을 얻을 수 있었다. 또한 0.015 mM의 $CaCl_2$를 첨가하여 고정화 CGTase의 재사용성을 관찰한 결과, 5회까지 50% 이상의 AA-2G 생산율로서 그 가능성을 입증할 수 있었다. 그리고 효소의 재사용성이란 측면에서, 본 고정화의 다른 한 방법인 ultrafiltration(한외 여과)에 의해서는 Millipore사의 YM 10 membrane을 이용하여 먼저 단백질량과 효소 활성 변화를 측정하여 그 가능성을 확보할 수 있었으며, 기질 20 ml을 사용하여 AA-2G를 생성시킨 후, 한외여과에 의해 효소만을 회수하여 연속 반응해 본 결과 8회까지 50%의 생성률을 유지하였다. 따라서 한외 여과는 CNBr-sepharose 4B와 함께 효율적인 고정화의 한 방법으로 판명되었으며, 앞으로 이들 고정화 효소를 이용한 연속 반응 시스템의 구축이 뒤따라야 할 것이다.
내열성의 cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase)를 이용하여 열에 안정한 싸이클린 텍스트린 (CD)을 생산하기 위하여 매우 높은 CGTase 활성을 보이는 고열성이며 호알카리성인 B-13세균을 분리하여 형태적, 생리학적 특성과 16S 리보솜 RNA 서열분석 등을 통하여 Bacillus cereus B-13으로 동정하였다. Bacillus cereus B-13 2% 가용성 전분, 1% 효모 추출물, 1% $Na_2CO_3$ 등을 함유하는 SYC 배지 (pH 8.5)에 접종하여 $50^{\circ}C$에서 24시간 배양하였을 때 최고의 CGTase 활성(130 U/ml)을 보였다. 또한 부분 정제된 CGTase의 작용 최적 온도와 pH는 각각 $60^{\circ}C$, pH 8.5-9.0 이었고 $80^{\circ}C$이하와 pH5.0-10.0에서 안정하였다. 1% 가용성 전분을 부분 정제한 CGTase와 작용시켰을 때 49%의 CD 수율을 보였다.
Microbial degradation of hydrocarbons is found to be an attractive process for remediation of contaminated habitats. However the poor bioavailability of hydrocarbons results in low biodegradation rates. Cyclodextrins are known to increase the bioavailability of variety of hydrophobic compounds. In the present work we purified the Cyclodextrin Glucanotransferase (CGTase) enzyme which is responsible for converting starch into cyclodextrins and studied its role on biodegradation of diesel oil contaminated soil. Purification of CGTase from Enterobacter cloacae was done which resulted in 6 fold increase in enzyme activity. The enzyme showed maximum activity at pH 7, temperature $60^{\circ}C$ with a molecular weight of 66 kDa. Addition of purified CGTase to the treatment setup with Pseudomonas mendocina showed enhanced biodegradation of diesel oil ($57{\pm}1.37%$) which was similar to the treatment setup when added with Pseudomonas mendocina and Enterobacter cloacae ($52.7{\pm}6.51%$). The residual diesel oil found in treatment setup added with Pseudomonas mendocina at end of the study was found to be $73{\pm}0.21%$. Immobilization of Pseudomonas mendocina on alginate containing starch also led to enhanced biodegradation of hydrocarbons in diesel oil at 336 hours.
Park, So-Lim;Kwon, Mi-Jung;Kim, Sung-Koo;Nam, Soo-Wan
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제14권1호
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pp.216-219
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2004
The effect of culture temperature on the production of soluble form of B. macerans cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) in recombinant E. coli was investigated. E. coli cell was cotransformed with two plasmids (pTCGT1 and pGroll) in which the cgt and groEL/ES genes are under the control of T7 promoter and pzt-1 promoter, respectively. When tetracycline (10 ng/ml) and IPTG (l mM) were added as inducers at the early-exponential phase (2 h) and mid-exponential phase (3h), respectively, the solubilization of the inclusion body CGTase was greatly dependent on the temperature of the culture. At low culture temperature of $25^\circ{C}$, 2- or 3-fold higher activity and specific activity were obtained over $37^\circ{C}$. SDS-PAGE analysis revealed that about 62% of CGTase in the total CGTase protein was found in the soluble fraction by applying overexpression of GroEL/ES chaperone and by cultivation of E. coli at $25^\circ{C}$, whereas 33% of CGTase was detected in the soluble fraction at $37^\circ{C}$. Therefore, the expression of GroEL/ES and cultivation at $25^\circ{C}$ greatly enhanced the soluble production of CGTase in E. coli.
한국미생물학회 2003년도 International Meeting of the Microbiological Society of Korea
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pp.122-124
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2003
Cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) and endoxylanase genes of Bacillus sp. were subcloned down-stream of yeast ADH1 promoter and expressed in S. cerevisiae. Most of the CGTase and endoxylanase expressed were detected in the extracellular medium with activity of 0.6 and 7-8 unit/ml, respectively. The recombinant enzymes were secreted as N-linked-glycosylated forms, resulting an enhanced thermal stability. CGTase predominantly produced $\alpha-cyclodextrin$ from starch and endoxylanase produced xylobiose and xylotriose from xylan.
김치 시료로부터 자동산화되지 않으며 열 및 중성 pH에서 안정한 AA 유도체인 AA-2G를 생산할 수 있는 당전이활성을 가진 CGTase 생산균주를 분리하였고, 분리균주의 형태학적, 배양학적, 생리학적 성질 및 16s-rDNA sequences를 조사한 결과 그람 양서의 간균으로 호기성이며 내생포자를 형성하는 전형적인 중온성 Bacillus sp. JK-43으로 동정되었다. Bacillus sp. JK-43의 CGTase는 AA-2G 뿐만 아니라 AA-6G로 추정되는 물질을 함께 생산하였으며, 효소 최적생산조건은 1.0% soluble starch, 1.0% yeast extract, 1.0% $Na_2CO_3\;0.1%\;K_2HPO_4,\;그리고\;0.02%\;MgSO_4{\cdot}7H_2O$가 함유된 배지에서 pH 7.0, $37^{\circ}C$에서 26시간 동안 진탕배양하였을 때였다. 각종 당공여채에 따른 Bacillus sp. JK-43의 AA-2G 생산성을 조사한 결과 ${\beta}-CD$에서 가장 높은 AA-2G 생산성을 보였으며, 식혜제도페액인 엿기름 및 밥당화액에서도 비교적 높은 AA-2G 생산성을 보였다. 또한 여러 가지 당수용체에 대한 JK-43의 CGTase의 당전이 반응을 검토한 결과 sucrose, mannitol 및 inositol에서 높은 당전이 수율인 70~90%를 나타내었다.
Kim, Chung-Im;Kim, Myoung-Dong;Park, Yong-Cheol;Han, Nam-Soo;Seo, Jin-Ho
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제10권5호
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pp.632-637
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2000
This research was undertaken to restore the biological activity of cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) of Bacillus macerans origin expressed as inclusion bodies in recombinant Escherichia coli. The optimum concentration of urea used as a denaturant was 8 M. The supplementation of 0.5 M urea into a dialysis buffer increased the refolding efficiency by preventing any protein aggregation. The influence of the protein concentration, temperature, and pH were also investigated. The protein concentration was found to be the most important factor in the refolding efficiency. The optimum temperature was 15-$25^{\circ}C$ and the optimum pH was 6.0. The maximum specific activity of the CGTase refolded under the optimum conditions was 92.2 U/mg, corresponding to 72% of the native CGTase. A comparison of the secondary structure between the native and the refolded CGTase showed that the relative ratio of the $\alpha$-helix content in the native to the refolded CGTase was 1:0.82.
Kim, Chang-Sup;Han, Nam-Soo;Kweon, Dae-Hyuk;Seo, Jin-Ho
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제9권2호
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pp.230-233
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1999
A plasmid vector was constructed for the expression and secretion of Bacillus macerans cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) in Bacillus subtilis. The vector, pUBACGT, was composed of the ribosome-binding sequence, signal sequence, and cgt gene from B. macerans under the control of amyR2, the promoter of amyE gene coding for $\alpha$-amylase from B. subtilis var. natto. Bacillus subtilis LKS88, a mutant strain lacking genes for an amylase and two proteases, was used as a host for the transformation of the plasmid vector. The transformants were selected on kanamycin-containing Luria-Bertani plates. The starch hydrolyzing activity was observed on the starch-containing plates by the iodine method and cyclodextrin-forming activity was detected in the culture medium. A SDS-PAGE analysis showed that most of the expressed CGTase in the recombinant B. subtilis was secreted into the medium at a high expression level.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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