Canine follicular oocytes were used to establish a reliable system for maturation and fertilization in vitro. Ovaries were obtained from either slaughter house or hormone-primed bitches of mixed breeds. The oocytes were recovered by mincing the ovaries in M2+BSA. Good quality of oocyte-cumulus complexes (OCCs) were selected and cultured in TCM 199 containing 15% fetal calf serum(FCS) for 24~56 h in an atmosphere of 5% CO2 at 39$^{\circ}C$. Maturation rate of follicular oocytes was >87% showing metaphase I. Unlike other domestic animals the cumulus expansion did not occur fully in canine OCCs although minimum expansion was found between the cumulus cells and corona radiata cells, the clear nuclear morphology was presented for the first time by rapid staining. The IVM system used in this study may be useful to obtain fully maturated metaphase I oocyte in dog.
To determine the differences in the in-vitro ovum maturation process of bovine, we compared the expression of MMPs in these oocytes and cumulus cell throughout oocytes maturated. In an attempt to investigate the effect of MMP activation and inhibitors in total protein of cumulus cell and, oocytes during oocytes maturation, we examined and monitored the localization and expression of MMPs (MMP-2 and MMP-9), TIMPs (TIMP-2 and TIMP-3), as well as their expression profiles (Real-time PCR, Gelatin Zymography and ELISA). Our results that the bovine oocytes MMP-2 and MMP-9 level was significantly associated with the rate of maturity of oocytes (P<0.05). In cumulus cell, MMP-2 was highly expressed in all stages of the oocyte's maturation. The final oocytes maturation exhibited strong gelatinase activity. There was no significant correlation between cumulus cell MMP-9 and the maturation rate of oocytes. However, for the oocyte cytoplasm MMP-9 expression was significant correlation to the maturation oocytes. There was no significant correlation between cumulonimbus cells MMP-9 and oocyte maturation rates; however, for oocyte cytoplasm, MMP-9 expression was significantly correlated with mature oocyte. However, the TIMP-1 and TIMP-2 protein expression patterns are not correlated with the maturation rate of the oocyte. Our results suggest that MMP different expression pattern may regulate the morphological remodeling of oocyte's in the cumulus cell. Further, the MMP-2 expression has a strong relation with a higher maturation rate of the oocyte.
These experiments were carried out to investigate whether zona hardening affect the efficiency of in vitro fertilization in mouse oocytes. The soluble properties for zona pellucida of oocytes matured in vivo, aged oocytes, and ovarian oocytes matured in vitro have been analyzed with proteolytic enzyme, 3mg/ml of $\alpha$-chymotrypsin. The mean solubility(t50) for the zona of unfertilized oocytes, oocytes not fertilized at the first inseminati and in vitro produced zygotes were 10.1, 20.3 and 32.3min., respectively. The t50 for zona lysis of fertilized oocytes was significantly difference than those observed for unfertilized oocytes and oocytes not fertilized at the first insemination(P<0.01). In addition, the t50 of zona in ovulated oocytes with and without cumulus cells incubated for 0, 3, 6, 9 and 12 hr in vitro, t50 were 13.9, 11.1, 20.7 and 28.0min., and 22.3, 21.0, 30.0 and 33.5min., respectively. In these experiments, the zona pellucida showed a gradual increase in resistance to dissolution by $\alpha$-chyjotrypsin with in vitro aging for more than 6 hrs. This effect was greater in cumulus-free as compared to cumulus-intact oocytes. Finally, in cumulus-intact and cumulus-free ovarian oocytes matured for 0, 5, 10 and 15 hr in vitro the t50 of zona pellucida were 3.0, 10.6, 18.4 and 24.5 min., and 3.0, 14.0, 26.2 and 32.0 min., respectively. Clear differences in solubility between the zona pellucida of oocytes matured in vivo and in vitro. This data were found suggest that under in vitro conditions there is a gradual change in the soluble properties of the zona pellucida, particularly in the absence of the cumulus cells.
The effect of protein supplementation, $O_2$ concentration and co-culture on the development of embryos produced by nuclear transfer using cultured cumulus cell was investigated. Recipient oocytes and cumulus cells were obtained from the ovaries of the slaughtered Hanwoo cows. Donor cumulus cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum at 5% $CO_2$ in air at $38.5^{\circ}C$. The 1 to 6 passages of cumulus cells were isolated and used as donor cells. The in vitro matured oocytes were enucleated and then the isolated donor cells were introduced. One $15{\mu}s$ pulse of 180 volts was applied to induce the fusion between karyoplast and cytoplast. The fused embryos were activated with $10{\mu}M$ calcium ionophore for 5 min and 2 mM 6-dimethylaminopurine for 3 h. To examine the effect of protein supplementation, nuclear transfer (NT) embryos were cultured in one of the following 4 treatments : 1) CR1aa + 3 mg/ml BSA for 7 days ; 2) CR1aa + 10% FBS for 7 days ; 3) CR1aa + 1.5 mg/ml BSA + 5% FBS for 7 days ; and 4) CR1aa + 3 mg/ml BSA for first 3 days and then CR1aa + 1.5 mg/ml BSA + 5% FBS for 4 days. Culture took place at 5% $CO_2$, 5% $O_2$ and 90% $N_2$ at $38.5^{\circ}C$. Although there were no significant differences in cleavage rate among different protein supplements, the rates of blastocyst formation were significantly different. When NT embryos were cultured in the medium supplemented with only BSA, they could develop to only morula not to blastocyst. However, when FBS was supplemented, NT embryos developed to blastocyst stage. In order to investigate the effect of $O_2$ concentration and co-culture, NT embryos were cultured in CR1aa + 1.5 mg/ml BSA + 5% FBS with or without cumulus cell co-culture at an atmosphere of 5% $CO_2$ in air (20% $O_2$) or 5% $CO_2$, 5% $O_2$, 90% $N_2$ (5% $O_2$) at $38.5^{\circ}C$ for 7 days. The percentage of blastocyst development was significantly higher when the NT embryos were cultured at an atmosphere of 5% $O_2$ than that of 20% $O_2$ (p<0.05). However, there was no significant difference between with and without cumulus cell co-culture at an atmosphere of 5% $O_2$ or 20% $O_2$. Fifty embryos were transferred to 25 recipients and 5 recipients were pregnant at 100 days. From 5 pregnant cows, only one cow was delivered of female twin. In conclusion, the embryos reconstructed by enucleation of metaphase II oocytes and introduction of the cycling and quiescent cumulus donor cells in Hanwoo had developmental potential to term after embryo transfer to recipient cows.
The study was carried out to investigate the effects of morphology, preservation and reproductive cycle of oocytes in vitro maturation of cats oocytes and development of IVM embryos. The results were summarized as follows : 1. Nuclear status of GV and MI of in vitro cultured(24 h) oocytes with and whithout cumulus cells were 74.3% and 25.7%, 28.6% and 11.4%, 77.1% and 5.7%, respectively, The rate of oocytes with cumulus cells was higher than that of denuded oocytes. 2. Nuclear status of GV and MI of in vitro cultured(24 h) oocytes recovered from ovaries collected at different stages of the reproductive cycle(inactive, follicular and luteal) were 88.6% and 6.5%, 60.0% and 11.4%, 77.1% and 5.7%, respectively. 3. Nuclear status of fresh and salts-stored oocytes with and whithout cumulus cells were 74.3%, 25.7% and 37.1%, 11.4% and 57.1%, 13.3%, 17.1%, 3.3%, respectively. The rate of oocytes with cumulus cells(13.3%∼74.3%) was higher than that of denuded oocytes(3.3%∼57.1%).
The study was carried out to investigate the effects of morphology, reproductive cycle, incubation time and activation of oocytes on in vitro maturation of cat oocytes and development of IVM/IVF embryos. The results were summarized as follows: 1. When recovered from ovaries collected at different stages of the reproductive cycle (inactive, follicular and luteal stage), the developmental rates of oocytes to GV and MI stage were 72.5% and 27.5%, 57.5% and 7.5%, 62.5% and 17.5%, respectively. 2. The developmental rates of oocytes with cumulus cells to GV and MI stage in different conditions of incubation (5% $CO_2$ , 95% $O_2$ and 10% $CO_2$, 90% $O_2$) were 70.0% and 27.5%, 52.5% and 20.0%, 55.0% and 12.5%, respectively. 3. The developmental rates to GV and MI oocytes when cultured at different time of incubation (17∼20, 21∼24, 25∼28 and 29∼32 h) were 67.5% and 20.0%, 67.5% and 30.0%, 62.5% and 22.5%, 65.0% and 15.0%, respectively. 4. The fertilization and cleavage rates of freshly collected oocytes with and without cumulus cells were 72.5% and 25.0%, 37.5% and 7.5%, respectively. The rates were greater in oocytes with cumulus cells than those without cumulus cells. 5. The fertilization and cleavage rates of oocytes recovered from ovaries collected at different stages of the reproductive cycle (inactive, follicular and luteal stage) were 75.0% and 25.0%, 40.0% and 7.5%, 50.0% and 15.0%, respectively.
This study was conducted to investigate the effects of Trichostatin A (TSA) on cumulus expansion during mouse oocyte maturation. TSA treatment inhibited cumulus expansion and significantly reduced the cumulus expansion index (CEI) (p<0.05). To determine the underlying mechanism, the expression levels of several key factors that play crucial roles in cumulus expansion including components of extracellular matrix (ECM) (Has2, Ptgs2, Ptx3, and Tnfaip6) and Growth differentiation factor 9 (GDF9) were measured in control and TSA treated samples by real-time PCR. The effect of TSA on ERK phosphorylation (p-ERK1/2) in cumulus cells and GDF9 protein level in fully grown oocytes (FGOs) were detected by Western blotting. The expression levels of the ECM genes were significantly decreased (p<0.05) by TSA treatment while GDF9 expression did not response to TSA (p>0.05). TSA treatment blocked the activation of ERK1/2 (p<0.05) and had no significant effect on GDF9 protein expression (p>0.05). Collectively, these results suggested that TSA treatment altered ECM gene expression and blocked ERK1/2 activation to inhibit cumulus expansion in the mouse.
When mammalian oocytes undergo maturation, cumulus cells surrounding the oocyte exhibit remodeling of their structure known as cumulus expansion. Many molecules including hyaluronic acid participate in this remodeling. The present study aimed to investigate a possible existence of matrix metalloproteinases(MMPs) in the extracellular matrix(ECM) of human oocyte-cumulus complex. ECM was extracted from the human oocyte-cumulus complex. Gelatin gel zymogram of ECM exhibited 7 gelatinases having molecular weight of 300kDa, 240kDa, 200kDa, 180kDa, 116kDa, 97kDa, and 84kDa. This gelatinase profile was very different from that of ovarian mural granulosa cell extract or white blood cell extract, indicating that the oocyte-cumulus complex donating ECM was free from other than cumulus cells. When ethylenediaminetetraacetic acid or 1', 10'-phenanthroline was added to the reaction buffer during zymographic development, almost gelatinase activities were abolished, suggesting that they were MMPs. Following incubation of ECM in the presence of aminophenylmercuric acetate, an activator of proMMPs, 4 gelatinases of 240kDa, 180kDa, 97kDa, and 84kDa disappeared with the concomitant appearance of 80kDa, 65kDa, and 60kDa gelatinases. Based upon these observation, it is suggested that ECM of the human oocyte-cumulus complex consists of gelatinases, presumed to be MMP-2 and MMP-9 isoforms.
Germ cell-specific hyaluronidases such as sperm adhesion molecule 1 (SPAM1) and hyaluronoglucosaminidase 5 (Hyal5) are in part responsible for dispersal of the cumulus cell mass, which is a critical step in establishing fertilization in mammals. In this study, we identified two testis-hyaluronidases, SPAM1 and Hyal5, in hamster and rat. These two genes were expressed specifically in the testis. At the protein level, hamster SPAM1 and Hyal5 display 78.7% and 75.4% identity with mouse SPAM1 and Hyal5. Further, the activity of the enzymes with respect to cumulus cell dispersion did not differ, although we observed that the enzymatic activity differed in pH range. These studies suggest that different sperm hyaluronidases are capable of dispersing the cumulus cell mass despite differences in enzyme activity.
This study was undertaken to investigate the effects of ITS and EGF on embryonic development of in vitro matured and fertilized bovine oocytes in culture medium su, pp.ementing with or without calf serum. When fertilized oocytes were cultured in TCM-199 containing 0, 0.1, 0.5 and 1.0\ulcorner/ml ITS with 5% calf serum, the rates of development to blastocyst stage and the cell number of blastocysts were not significantly different among all treatments. And also monolayer of cumulus/granulosa cells prepared in containing calf serum and ITS were no beneficial effects of embryonic development. On the other hand, when EGF was su, pp.imented to TCM-199 containing calf serum or calf serum free, embryonic development rates(24.0 2.8% to 29.2 1.7% or 8% to 9%) and cell number of blastocysts(p<0.05) were significantly increased compared with EGF-free(22.1 2.1 or 1.0%, p<0.05). But when fertilized oocytes were cultured with cumulus/granurosa cells in TCM-199 containing EGF and calf serum, the rate of embryos development to the blastocyst stage and cell number of blastocysts were not significantly different compared with EGF-free and any concentrations. These results showed that ITS and EGF was not improved the development of bovine embryo in vitro matured and in vitro fertilized with calf serum and/or monolayer of cumulus/granulosa cells.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.