• Restorative Dentistry and Endodontics
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• 제24권1호
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• pp.13-25
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• 1999

P. endodontalis which was known to be associated with the infected root canals and periapical lesions is very difficult to detect by culture methods or traditional methods. Detection of bacteria using polymerase chain reaction(PCR) for 16S ribosomal DNA(rDNA) is fast, simple, and accurate with relatively small amount of target cells. 16S rDNA consist of conserved regions those are same to all species, and variable regions which represent species specificity. The 16S rDNA sequences of P. endodontalis and P. gingivalis were aligned and two highly variable regions were selected as a pair of species specific oligonucleotide primers for P. endodontalis. And then the pair of primers for PCR amplification was synthesized to identify P. endodontalis. The sequences of the species specific primers for the 16S rDNA of P. endodontalis were as follows ; sense primer[endo1]: 5'-CTATATTCTTCTTTCTCCGCATGGAGGAGG-3' antisense primer[endo2]: 5'-GCATACCTTCGGTCTCCTCTAGCATAT-3' In this study, for the identification of P. endodontalis without culture from the mixed clinical samples, PCR was done with species specific primers for the 16S rDNA sequences of P. endodontalis. The results were as follows : 1. The species specificity of the primers for the 16S rDNA of P. endodntalis was determined by the PCR methods. About 490bp amplicon which was specific only for P. endodntalis was produced with P. endodontalis. No amplicon was produced by PCR with other strains similar to P. endodontalis. 2. The synthesized species specific primers reacted with conventionally identified P. endodontalis which we have in conservative dentistry laboratory. 3. The identification of P. endodontalis using PCR technique with samples collected from infected root canals or periapical lesions was more sensitive than that of culture methods. 4. Seven samples revealed including P. endodontalis by PCR technique. Five of them were related with pains, two of them with sinus tract, three of them with foul odor, and three of them with purulent drainage. P. endodontalis was shown to have great relation with pains.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권11호
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• pp.1944-1953
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• 2015

A novel alkaline protease from Streptomyces sp. M30, SapHM, was purified by ammonium sulfate precipitation, hydrophobic interaction chromatography, and DEAE-Sepharose chromatography, with a yield of 15.5% and a specific activity of 29,070 U/mg. Tryptic fragments of the purified SapHM were obtained by electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Nucleotide sequence analysis revealed that the gene sapHM contained 1,179 bp, corresponding to 392 amino acids with conserved Asp156, His187, and Ser339 residues of alkaline protease. The first 24 amino acid residues were predicted to be a signal peptide, and the molecular mass of the mature peptide was 37.1 kDa based on amino acid sequences and mass spectrometry. Pure SapHM was optimally active at 80℃ in 50 mM glycine-NaOH buffer (pH 9.0), and was broadly stable at 0-50℃ and pH 4.0-9.0. The protease relative activity was increased in the presence of Ni²⁺, Mn²⁺, and Cu²⁺ to 112%, 113%, and 147% of control, respectively. Pure SapHM was also activated by dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, Tween 80, and urea. The activity of the purified enzyme was completely inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride, indicating that it is a serine-type protease. The K_m and V_max values were estimated to be 35.7 mg/ml, and 5 × 10⁴ U/mg for casein. Substrate specificity analysis showed that SapH was active on casein, bovine serum albumin, and bovine serum fibrin.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제22권8호
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• pp.1107-1112
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• 2009

The separation of X and Y chromosome-bearing sperm is of use in many aspects of livestock maintenance. In this study, we sought to determine the difference in DNA content between X- and Y-bearing sperm, separate sperm into X- and Y-enriched pools, and assess the efficacy of sorting. Sperm collected from Duroc and miniature pigs were stained with 20.8 $\mu{M}$ Hoechst 33342 and analyzed using a high-speed cell sorter. Measurement of the fluorescence intensity of stained sperm nuclei revealed that the X-bearing sperm of Duroc and miniature pigs respectively contain 2.75% and 2.88% more DNA than Y-bearing sperm. In total, 50.18% of the sperm were assigned to the X-sorted sample and 49.82% was assigned to the Y-sorted sample for Duroc pigs. For miniature pigs, the Xsorted sample represented 50.19% of the population and the Y-sorted represented 49.81% of the population. Duplex PCR was used to evaluate accuracy of sorting. A fast and reliable method for porcine sexing was developed through amplification of the sex-determining region of the Y chromosome gene (SRY). Oligonucleotide primers were designed to amplify the conserved porcine SRY high motility group (HMG) box sequence motif. We found that the primer pair designed in this study was 1.46 times more specific than previously reported primers. Thus, this study shows that the present method can be applied in porcine breeding programs to facilitate manipulation of the sex ratio of offspring and to achieve precise sexing of porcine offspring by amplification of the HMG box of the SRY gene.

• Applied Biological Chemistry
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• 제38권1호
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• pp.49-54
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• 1995

한국 마늘에 감염된 바이러스의 종류와 병 발생 메카니즘을 구명하기 위하여, 마늘 바이러스 cDNA clone들을 분리하였다. 24개 cDNA clone들의 부분적인 염기 서열을 결정하였고, 이 중 poly(A) tail을 가진 5개 clone들의 염기 서열을 결정하였다. 이를 이미 알려진 다른 식물 바이러스와 비교했을 때, clone V9은 일차구조가 carlavirus와 유사성을 보이므로 GLV cDNA clone으로 여겨진다. Northern blot 결과로부터 GLV genome의 크기는 8.5 knt이고, poly(A) tail을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. clone V9의 3' 말단부분에는 바이러스 복제과정에서 cis-acting element로 작용한다고 여겨지는 hexanucleotide motif(5'-ACCUAA)가 존재한다. 또한 carlavirus의 껍질 단백질 subgenomic RNA의 5' 말단에 보존되어 있는 5'-TTAGGT도 나타난다. 이들은 모두 carlavirus의 특징들이다. 껍질 단백질 유전자를 pRSET-A 발현 벡터에 재조합하고, E. coli BL21에서 발현시켰다. 발현된 껍질 단백질을 $Ni^{2+}$ NTA affinity chromatography에 의해 정제하였다. 껍질 단백질을 토끼에 주사하여 항체를 만든 후, immunoblot을 한 결과 GLV 껍질 단백질에 해당하는 24 kDa polypeptide가 인지되었다. 또한 다양한 마늘 품종에 대해서 immunoblot을 한 결과, GLV 껍질 단백질의 크기와 GLV의 감염정도가 마늘 품종에 따라서 차이가 있다는 것을 알 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권12호
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• pp.2125-2134
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• 2015

IrrE is a highly conserved global regulator in the Deinococcus genus and contributes to survival from high doses of UV radiation, ionizing radiation, and desiccation. Drad-IrrE and Dgob-IrrE from Deinococcus radiodurans and Deinococcus gobiensis I-0 each share 66% sequence identity. However, Dgob-IrrE showed a stronger protection phenotype against UV radiation than Drad-IrrE in the D. radiodurans irrE-deletion mutant (ΔirrE), which may be due to amino acid residues differences around the DNA-binding HTH domain. Site-directed mutagenesis was used to generate a Drad-IrrE A184S single mutant, which has been characterized and compared with the ΔirrE mutant complemented strain with Drad-irrE, designated ΔirrE-E. The effects of the A184S mutation following UV radiation and mitomycin C (MMC) shock were determined. The A184S mutant displayed significantly increased resistance to UV radiation and MMC shock. The corresponding A184 site in Dgob-IrrE was inversely mutated, generating the S131A mutant, which exhibited a loss of resistance against UV radiation, MMC shock, and desiccation. qPCR analysis revealed that critical genes in the DNA repair system, such as recA, pprA, uvrA, and ddrB, were remarkably induced after UV radiation and MMC shock in the ΔirrE-IE and A184S mutants. These data suggested that A184S improves the ability against UV radiation and MMC shock, providing new insights into the modification of IrrE. We speculated that the serine residue may determine the efficiency of DNA binding, leading to the increased expression of IrrE-dependent genes important for protection against DNA damage.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제35권4호
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• pp.278-284
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• 2007

생체 염 농도에서도 항균활성을 유지할 수 있는 선형 ${\alpha}$-helical 항균 펩타이드를 M13 펩타이드 라이브러리로부터 탐색할 수 있는 새로운 방법을 개발하였다. M13의 pIII은 magainin 유도체인 MSI-344와 indolicidin과 융합된 상태에서도 파아지의 viability에 영향을 주지 않는 것으로 보아, MSI-344와 indolicidin의 대장균에 대한 독성을 중화할 수 있는 것으로 판단되며, 따라서 대장균에서 항균 펩타이드 라이브러리의 제조가 가능함을 증명하였다. 선형 항균 펩타이드의 보존된 부위를 바탕으로, 13개의 아미노산 잔기로 구성된 semi-combinatorial 항균 펩타이드 라이브러리를 M13를 이용하여 제조하였다. 제조된 파아지 라이브러리는 먼저 적혈구에 흡착시켜, 높은 용혈 역가를 가질 가능성이 있는 파아지를 제거한 후, 높은 염 농도에서 Pseudomonas aeruginosa와 Staphylococcus aureus에 흡착할 수 있는 파아지를 탐색하였다. 탐색된 펩타이드들은 염이 없는 조건에서는 비교적 낮은 항균 역가를 보였지만, P06와 S18 펩타이드의 경우, 생체 염 농도보다 높은 150 mM $Na^+$, 2 mM $Mg^{2+}$, 2 mM $Ca^{2+}$의 조건에서도 항균 역가가 영향을 받지 않았으며, 심각한 용혈 역가 또한 보이지 않았다. 본 연구에서 개발한 대상 세균에 대한 흡착능력을 이용한 탐색방법은 salt-tolerant antimicrobial peptide의 개발의 새로운 가능성을 제시하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제45권3호
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• pp.226-235
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• 2017

Phytoene, lycopene, ${\beta}-carotene$과 같은 카로티노이드는 식품의 착색제나 영양보조제, 사료첨가제, 화장품의 원료로 사용된다. 이전 연구에서 본 연구진은 분홍색의 색소를 생산하는 새로운 해양 세균인 K. gwangalliensis를 분리 동정하였다. Phytoene desaturase (CrtI) 효소는 crtI 유전자에 암호화되어 있으며, phytoene을 lycopene으로 전환하며, 카로티노이드 합성 초기 단계에 있어서 필수적이다. CrtI는 카로티노이드 생합성 조절의 주요 효소 중 하나이며, 다양한 카로티노이드를 생합성하는 생물들의 카로티노이드 생합성 경로에 있어서 속도 조절 단계에 관련이 있다. 본 논문에서는 K. gwangalliensis로부터 lycopene 생합성을 담당하는 crtI 유전자를 클로닝 하였으며, 이 유전자는 1,584개의 염기서열을 가지며, 527개의 아미노산을 암호화하고 있다. crtI 유전자의 염기 서열을 Kocuria rhizophila와 Myxococcus xanthus를 포함한 다른 종의 염기 서열과 비교한 결과, 진화 과정에서 잘 보존되어 있음을 확인하였다. crtI 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 구축하여 발현시킨 결과, 이 플라스미드를 함유하는 대장균은 약 57 kDa의 재조합 단백질을 생산화였으며, 이는 phytoene desaturase의 분자량에 해당한다. lycopene의 생합성은 lycopene 생합성에 필요한 crtE, crtB 유전자를 포함한 pRScrtEB plasmid를 E. coli에 형질전환 했을 때, Escherichia coli에서 합성되는 것을 확인하였다. 이 연구의 결과는 분자 수준에서 K. gwangalliensis CrtI의 1차 구조에 대한 폭 넓은 지식 기반을 제공할 것이다.

• 한국식품저장유통학회지
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• 제18권2호
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• pp.184-190
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• 2011

Limonoid UDP-glucosyltransferase (LUGT)는 리모노이드에 포도당을 붙여줌으로써 궁극적으로 감귤에서 발생하는 limonoid bitterness를 제거해 주는 효소이다. 본 연구에서는 10종의 제주산 감귤로부터 LUGT유전자를 PCR 클로닝하고 그 염기서열을 비교했다. 실험에 사용한 모든 종에서 카르복실기 말단에 식물 당전달 효소에서 발견되는 전형적인 아미노산 서열인 p1ant secondary product glycosyltransferase(PSPG) 모티브가 존재했다. 아미노산 서열에 의한 계통수 분석을 실시해본 결과 10종의 제주산 감귤은 3그룹으로 분류했다. 각 그룹의 대표적인 3종 재래귤 품종 빈귤, 동정귤, 홍귤의 성숙 시기별 LUGT 발현양상은 delayed bitterness가 거의 없는 궁천과는 다른 양상을 나타내었다. 이러한 결과들은 빈귤, 동정귤, 홍귤과 같은 일부 재래귤 품종에서의 쓴맛은 LUGT발현이 지연됨에 따라 발생하는 delayed bitterness에 기인할 수 있음을 시사하고 있다.

• 미생물학회지
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• 제48권2호
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• pp.66-72
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• 2012

Nup188 단백질은 진화적으로 보존된 가장 큰 핵공단백질 중의 하나로 핵공복합체의 inner ring을 구성하는 인자이다. Nup188의 이종상동체인 분열효모 S. pombe의 Nup184 단백질은 영양분이 풍부한 완전배지(YES 배지)에서 정상적인 생장과 mRNA의 핵에서 세포질로의 이동에 필요하다. 본 연구에서는 ${\Delta}nup184$ 결실돌연변이를 YES 배지에서 배양할 때 보이는 생장지체와 mRNA export 결함을 상보하기 위해서 Nup184의 카르복시 부위(아미노산 잔기482에서 1628까지)가 필요함을 알아내었다. 또한 이 부위는 GFP-Nup184 융합단백질이 핵막에 위치하기 위해서도 필요하였다. 이 과정에서 S. pombe GeneDB (Sanger 연구소, 영국)에 등록되어 있는 Nup184의 열린읽기틀 (1564개의 아미노산 잔기로 된 단백질로 예측)이 우리가 얻은 염기서열 데이터에 비해 66개의 아미노산 잔기가 짧다는 것을 발견하였다. 이 카르복시-말단 부위는 Nup184의 기능에 반드시 필요하였다. 이외에도 Nup184 단백질이 세포 안에서 SUMO 변형되어 있음을 보였다.

• BMB Reports
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• 제39권5호
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• pp.502-510
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• 2006

2C-methyl-D-erythritol 2, 4-cyclodiphosphate synthase (MECPS, EC: 4.6.1.12) is the fifth enzyme of the non-mevalonate terpenoid pathway for isopentenyl diphosphate biosynthesis and is involved in the methylerythritol phosphate (MEP) pathway for ginkgolide biosynthesis. The full-length mecps cDNA sequence (designated as Gbmecps) was cloned and characterized for the first time from gymnosperm plant species, Ginkgo biloba, using RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique. The full-length cDNA of Gbmecps was 874 bp containing a 720 bp open reading frame (ORF) encoding a peptide of 239 amino acids with a calculated molecular mass of 26.03 kDa and an isoelectric point of 8.83. Comparative and bioinformatic analyses revealed that GbMECPS showed extensive homology with MECPSs from other species and contained conserved residues owned by the MECPS protein family. Phylogenetic analysis indicated that GbMECPS was more ancient than other plant MECPSs. Tissue expression pattern analysis indicated that GbMECPS expressed the highest in roots, followed by in leaves, and the lowest in seeds. The color complementation assay indicated that GbMECPS could accelerate the accumulation of $\beta$-carotene. The cloning, characterization and functional analysis of GbMECPS will be helpful to understand more about the role of MECPS involved in the ginkgolides biosynthesis at the molecular level.