• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.219-227
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• 2004

본 연구는 체외 성숙액인 TCM-199 배지를 기초로 무혈청첨가물인 PVA, PVP 및 pFF의 한정배지를 이용하여 돼지 미성숙난자의 체외성숙, 수정 및 배양 후 난자의 수정율과 배발달에 미치는 영향과 나아가 BSA 대체물로서의 이용 가능성을 알아보았다. 1. 무혈청 첨가물을 이용하여 난포란의 체외 성숙을 유기한 결과 PVA, PVP, pFF, BSA의 전체 분할율은 각각 82.4%, 78.6%, 89.4%, 90.0%로 나타났으며, GV, MI-MII율은 PVA 첨가시 각각 15.1%, 84.9%, PVP는 각각 26.5%, 73.5%, pFF는 각각 11.8%, 88.2%, BSA는 각각 11.1%, 88.9%로 PVA 혹은 pFF 첨가시에는 모두 BSA와 유사한 결과를 보였으나 PVP와는 유의적인 차이를 나타내었다 (P<0.05). 2. 체외 성숙된 난자를 수정시킨 후의 배발달율을 확인한 결과 전체 난할율은 PVA가 73%, PVP는 64.1% , pFF가 77.2%, BSA가 73%로 PVA와 pFF는 BSA와 유사하게 나타났으나, PVP는 그 발달율이 다른 처리군 들과 비교하여 유의적(P<0.05)으로 낮은 결과를 보였다. 3. 각 처리구간의 morulae와 blastocyst의 합을 비교한 결과 체외성숙 첨가물 중 PVA와 pFF는 각각 63%, 69%로 BSA(65%)와 유사한 결과를 나타내었으나 PVP는 54%로 유의적으로 낮은 결과를 나타내었다(P<0.05). 4. 전체 성숙율과 수정율을 비교해 본 결과 성숙 율은 PVA, pFF, BSA가 82.4%, 89.4%, 90.0%인 반면 PVP는 72.4%로 유의적으로(P<0.05) 낮은 결과를 보였고, 수정율은 pFF, BSA가 각각 87.1%, 89.1%로 PVA, PVP의 78.0%, 70.6%에 비해 각각 유의적(P<0.05)으로 높았다. 이상의 연구결과 돼지 난자의 체외성숙 및 배양 배지에 있어 PVA, pFF 첨가는 BSA 대체물로서 이용이 가능하나 PVP는 그 이용에 제한이 따를 것으로 판단된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제28권1호
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• pp.19-24
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• 2013

본 연구는 연중 비번식기에도 효율적인 재래산양 난포란의 확보가능성을 검토하고자 비번식기에 과배란 처리를 실시하여 체내 성숙난자 및 난포란을 회수하였으며, 회수란의 활성화를 유도하여 체외발달율을 조사하였다. 비번식기에 과배란 처리에 의한 배란점은 각각 $13.9{\pm}6.5$개로서, 번식의 $13.0{\pm}3.8$개와 차이가 없었다. 난관에서 외과적 관류방법으로 체내성숙난자를 회수하였을 회수율은 43.9%로서 번식기의 67.1%보다 낮았다(p<0.05). 공란 산양 두당 회수 난자수는 비번식기가 $5.9{\pm}5.2$개로서, 번식기의 $8.8{\pm}3.2$개보다 적었다. 공란 산양으로부터 체내 성숙난자 회수 후 난소의 난포로부터 주사기로 흡입하여 채란 시에 공란 산양 두당 난포수는 비번식기가 $5.8{\pm}4.6$개로서 번식기의 $7.5{\pm}3.9$개보다 적었으며(p<0.05), 회수율은 각각 68.7 및 54.7%로서 차이가 없었다. 공란 산양 두당 회수난자 수도 $3.9{\pm}3.2$ 및 $4.1{\pm}3.4$개로서 차이가 없었다. 회수한 난포란의 등급도 비번식기와 번식기간에 차이가 없었다. 비번식기에 회수한 체내성숙 난자를 단위발생을 유도하였을 때 분할율은 76.4%로서 번식기의 83.6%와 차이가 없었으며, 배반포기로의 발달율은 비번식기가 23.8%로서 번식기의 43.5%보다 유의적(p<0.05)으로 낮았다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권2호
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• pp.119-126
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• 2004

본 실험은 돼지체외수정란을 생산하는데 적합한 배양액과 산소조건을 구명하기 위하여 NCSU(North Carolina State University)-23, PZM(Porcine Zygotes Medium)-3, PZM-4 및 TCM(Tissue Culture Medium)-199 배양액과 5% 산소조건(39, 5% $O_2$, 5% $CO_2$ , 90% $N_2$ 및 포화습도) 및 20% 산소조건(39, 5% $CO_2$ 및 포화습도)에서 돼지 미성숙난포란의 체외성숙과 체외배발달을 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 돼지 난포란을 5 및 20% 산소조건하에서 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에 44시간 동안 성숙을 유도한 결과 난핵포붕괴율과 핵성숙률에 있어서 산소조건 및 배양액간 유의적(p>0.05)차이는 없었다. 2) 체외수정을 실시한 결과 정자 침투율, 자ㆍ웅전핵형성률, 다정자 침입률 및 평균정자수에 있어서 산소조건 및 배양액간에 유의적인 차이가 없었다. 3) 체외수정을 실시한 후, 5 및 20% 산소조건의 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에서 배양하여 배발달에 미치는 영향을 조사한 결과, 난할률에 있어서는 유의적(p＜0.05)인 차이가 없었으며. 배발달 7일째 배반포기 발달률에 있어서 5% 산소조건에서는 PZM-3 배양액이, 20% 산소조건에서는 NCSU-23 배양액이 유의적(p＜0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 4) 배발달 7일째 배반포기 배의 세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포수와 총세포수는 산소조건과 배양액간에 통계적인 유의성이 인정되지는 않았으나, 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액(36.8$\pm$6.5개)이 다소 높은 총세포수를 나타냈다. 위의 결과를 종합하면 돼지체외수정란의 생산에는 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액에서 배발달을 유도하는 것이 배반포기 발달률과 세포수에 있어 효과적이라고 판단된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제14권1호
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• pp.17-22
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• 1999

도축장에서 채취한 돼지난자를 직경별로 $5\mu\textrm{m}$ 간격으로 나누어, 난자의 크기에 따른 체외성숙과 발육능을 구명코자 체외성숙과 체외수정 후의 배 발달율을 조사하였다. 채취한 난자의 투명대를 제외한 평균직경은 $114.4\pm5.45\;\mu\textrm{m}$ 이었으며, 직경별 분포는 < 105, 105~110, 110~115,115~120, 120~125, $125\;\mu\textrm{m}$<이 각각 3.0, 11.0, 31.2, 41.5, 13.0 및 0.4%로 72.7%가 110부터 $120\;\mu\textrm{m}$ 사이였다. 체외성숙율에 있어서 직경 $105\;\mu\textrm{m}$ 미만난자는 66.7%인 반면 $105\;\mu\textrm{m}$ 이상의 난자는 91.8~100%로 유의적(P<0.05)으로 높았다. 체외수정율도 직경 $105\;\mu\textrm{m}$ 미만인 난자는 50% 이었던 반면, $105\;\mu\textrm{m}$이상은 8106~85.5%로 유의적(P<0.05)으로 높았다.다정자침입율에 있어서 $110\;\mu\textrm{m}$이상의 난자는 17.8~27.7%로 $105~110\mu\textrm{m}$ 의 37.5% 보다 낮았다. 난자의 직경별 배반포기까지의 발달율은 $105\;\mu\textrm{m}$ 이하는 전혀 발달하지 않았고(0%), $105~110\mu\textrm{m}$는 701%, $110~11\;5\mu\textrm{m}$ 12.5%, $115~120\; \mu\textrm{m}$ 24.0%, $120~125\; \mu\textrm{m}$ 18.3%, $120\; \mu\textrm{m}$<0%로, $115~120\; \mu\textrm{m}$ 직경난자의 체외발달율이 유의적(P<0.05)으로 높았다.이상의 결과를 종합할 때, 돼지의 체외수정용 나자는 직경 $110\; \mu\textrm{m}$ 이상을 이용하는 것이 생산성을 높일 수 있는 방법으로 사료된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권3호
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• pp.201-205
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• 2005

본 연구는 아미노산의 첨가가 돼지 수정란의 체외 발달율에 미치는 영향을 구명하고자 PEF가 함유된 NCSU-23을 기본배지로 체외성숙 및 체외배양액을 조성한 후 EA(Essential amino acid), NA(Non-essential amino acid) 및 EANA(EA+ NA)를 첨가하여 체외성숙, 체외수정 및 체외발달에 미치는 영향을 조사하였다. 체외성숙 배지에 아미노산을 첨가한 결과 MH 단계까지의 체외성숙율은 NA 첨가군이 $83.3\%$로 대조구 $70.0\%$에 비하여 유의적으로(p<0.05) 높았다. 그러나 체외 수정 이후의 배 발달율과 수정율에서는 아미노산 첨가군과 무첨가군 사이에 유의적인 차이는 없었다. 체외배양액에 아미노산을 첨가한 후 배반포의 내부세포괴(ICM) 세포와 영양배엽(TE) 세포의 발달에 미치는 영향을 조사한 결과, ICM에서는 유의차를 발견할 수 없었으나 TE 세포는 EANA 처리구가 $18.0{\pm}0.5$개로 대조구 $16.09{\pm}0.56$개에 비해 유의적(p<0.05)으로 많았다. 총세포수에서도 EANA 처리구가 $50.0{\pm}1.0$개로 대조구 $44.2{\pm}1.1$개보다 유의적(p<0.05)으로 많았다. 이상의 결과를 종합할 때, 돼지의 체외수정란 생상에 있어서 아미노산의 첨가는 배반포로의 발달율에는 영향을 미치지 못하였으나 체외성숙율을 높이고 배반포의 세포수 향상에 도움을 주는 것으로 판단된다. 특히, 영양배엽(W) 세포의 발달율이 높은 것으로 보아 아미노산의 첨가는 돼지수정란의 착상에 도움을 줄 것이라 기대된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제35권3호
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• pp.369-375
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• 2011

본 연구는 한우의 체외수정란 생산에서 체외성숙, 체외 배양시 배양액에 항산화제인 ${\alpha}$-Tocopherol의 첨가 농도에 따른 대조구와 처리구 난포란의 발달과 배반포 발생율 및 초자화 동결 후 생존성에 미치는 영향을 구명하고자 실험을 실시하였다. ${\alpha}$-Tocopherol 첨가 농도에 따른 분할율에서는 7~10월까지 비교한 결과, ${\alpha}$-tocopherol 200 ${\mu}M$ 첨가된 처리구가 대조구 및 타 처리구보다 높은 경향을 보였으나, 유의적 차이는 없었다. 배반포 발생율에서는 8~10월에서 ${\alpha}$-tocopherol 200 ${\mu}M$ 첨가된 처리구 $38.60{\pm}7.12%$가 대조구 및 타 처리구들보다 유의적으로 높게 (p<0.05) 나타났다. 초자화 동결 전 후의 총세포수는 ${\alpha}$-tocopherol 200 ${\mu}M$ 처리구에서 $115.80{\pm}6.61$개, $106.33{\pm}3.50$개로서, 다른 대조구 및 타 처리구보다 높은 세포수를 보였다. 월별에 따른 수정란의 배반포 발생율 및 동결 전후의 총세포수에서는 7~8월이 9~10월보다 유의적으로 높게 (p<0.05) 나타났다.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권2호
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• pp.119-126
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• 1996

본 연구는 30% Ficoll과 0.3M sucrose가 함유된 mDPBS 용액에 40%의 ethylene glycol을 첨가함으로서 제조된 EFS40을 이용하여 1-세포기의 생쥐수정란을 효율적으로 동결할 수 있는 적정 조건을 확립하기 위하여 실시하였다. 체외수정에 의해 생산된 생쥐수정란은 1단계 동결법 혹은 2단계 동결법, 두 가지 동결 방법에 의해 각각 초자화 동결되었으며, 동결 후, 융해된 수정란의 생존율은 2-세포기로 분할율과 배양 5일째 탈출배반포기로의 발달율로 각각 검증하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1단계 동결법에서, 수정란을 직접 초자동결액에 1분 동안 노출시켰을 때, 수정란의 생존율은 85.5%, 발달율은 31.9%였다. 수정란을 먼저 20% ethylene glycol에 1, 3, 5분간 노출시킨 후, 1분동안 EFS40 용액으로 옮겨 동결하는 2단게 동결법에서는 1단게 동결법보다 낮은 생존율을 보였다(65.4, 53.6 및 29.6%). 가장 높은 생존율(95.9%)은 EFS40에서 30초동안 노출이 1단계 동결법에서 얻을 수 있었다. 이 조건하에서 2-세포기로 분할된 수정란의 63.8%가 탈출배반포기로 발달하였다. 또한, Differential labelling 기법을 이용하여 Total과 ICM(inner cell mass)의 세포수를 조사한 결과, 초자 동결 후 발달된 배반포의 Total과 ICM 세포수(63.2$\pm$16.9, 13.5$\pm$4.0)와 대조군 세포수(54.0$\pm$15.2, 12.3$\pm$4.6)간에는 각각 유의차가 인정되지 않았다. 이러한 결과는 동결로 인한 수정란의 발달율은 다소 낮았지만, 동결후 융해된 수정란은 정상적으로 배반포까지 발달함을 보여준다. 이러한 결과로 미루어 보아, 본 실험에 사용된 초자화 동결 방법은 1-세포기 생쥐 수정란을 성공적으로 동결시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제14권9호
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• pp.1260-1266
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• 2001

The effect of protein supplementation, $O_2$ concentration and co-culture on the development of embryos produced by nuclear transfer using cultured cumulus cell was investigated. Recipient oocytes and cumulus cells were obtained from the ovaries of the slaughtered Hanwoo cows. Donor cumulus cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum at 5% $CO_2$ in air at $38.5^{\circ}C$. The 1 to 6 passages of cumulus cells were isolated and used as donor cells. The in vitro matured oocytes were enucleated and then the isolated donor cells were introduced. One $15{\mu}s$ pulse of 180 volts was applied to induce the fusion between karyoplast and cytoplast. The fused embryos were activated with $10{\mu}M$ calcium ionophore for 5 min and 2 mM 6-dimethylaminopurine for 3 h. To examine the effect of protein supplementation, nuclear transfer (NT) embryos were cultured in one of the following 4 treatments : 1) CR1aa + 3 mg/ml BSA for 7 days ; 2) CR1aa + 10% FBS for 7 days ; 3) CR1aa + 1.5 mg/ml BSA + 5% FBS for 7 days ; and 4) CR1aa + 3 mg/ml BSA for first 3 days and then CR1aa + 1.5 mg/ml BSA + 5% FBS for 4 days. Culture took place at 5% $CO_2$, 5% $O_2$ and 90% $N_2$ at $38.5^{\circ}C$. Although there were no significant differences in cleavage rate among different protein supplements, the rates of blastocyst formation were significantly different. When NT embryos were cultured in the medium supplemented with only BSA, they could develop to only morula not to blastocyst. However, when FBS was supplemented, NT embryos developed to blastocyst stage. In order to investigate the effect of $O_2$ concentration and co-culture, NT embryos were cultured in CR1aa + 1.5 mg/ml BSA + 5% FBS with or without cumulus cell co-culture at an atmosphere of 5% $CO_2$ in air (20% $O_2$) or 5% $CO_2$, 5% $O_2$, 90% $N_2$ (5% $O_2$) at $38.5^{\circ}C$ for 7 days. The percentage of blastocyst development was significantly higher when the NT embryos were cultured at an atmosphere of 5% $O_2$ than that of 20% $O_2$ (p<0.05). However, there was no significant difference between with and without cumulus cell co-culture at an atmosphere of 5% $O_2$ or 20% $O_2$. Fifty embryos were transferred to 25 recipients and 5 recipients were pregnant at 100 days. From 5 pregnant cows, only one cow was delivered of female twin. In conclusion, the embryos reconstructed by enucleation of metaphase II oocytes and introduction of the cycling and quiescent cumulus donor cells in Hanwoo had developmental potential to term after embryo transfer to recipient cows.

• 한국수정란이식학회지
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• 제16권2호
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• pp.107-115
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• 2001

본 연구는 최근 형질전환동물의 생산 및 복제동물 생산에 이용되고 있는 핵이식 기법을 시행할 때 재조합된 핵이식란의 활성화를 위해 널리 적용되고 있는 6-dimethylaminopurine (DMAP)의 활성화 효율과 근래에 제기되고 있는 단위발생란의 비정상적인 염색체 및 핵형에 대해 알아보고 적합한 활성화 유도물질을 찾고자 시행되어졌다. 도축장 유래의 난소에서 채란한 난자를 10% 거세한 수소혈청이 포함된 TCM-199배양에서 22시간동안 체외 성숙을 시킨 후 제 2감수분열 중기의 난자만을 선별해서 5$\mu$M ionomycin에서 5분간 처리하고 1.9 mM 6-dimethylaminopurine (DMAP)와 10$\mu\textrm{g}$/mL cycloheximide (CHX)에서 각 3시간동안 처리하여 활성화를 유도하였다. 활성화가 유도된 난자를 18시간 동안 체외 배양시 전핵 형성, 제 2 세포기까지 분할속도, 배 반포까지의 발달을 및 활성화 및 체외수정 후 108시간에 평균 세포수와 염색체를 분석하여 활성화 물질의 효율뿐만 아니라 문제점을 알아보고자 하였다. 1. 활성화 자극에 따른 난자의 전핵 형성은 ionomycin 처리 후 DMAP을 처리한 난자에서는 1PN 형성율이 9.1%로 ionomycin를 단독 처리하거나 ionomycin 처리 후 CHX를 처리한 난자에서의 1PN 형성율인 77.8와 79.0%보다 유의적 (P<0.05)으로 낮게 나타났으나, 3PN 형성율은 45.5%로 유의적 (P<0.05)으로 높게 나타났다. 따라서 ionomycin 처리 후 DMAP으로 활성화를 유도한 난자는 비정상적인 핵형을 가지지만 CHX로 활성화를 유도하였을 때는 정상적인 전핵 형성이 이루어지는 것으로 보인다. 2. 활성화 자극을 가한 난자의 체외 발달율은 ionomycin을 처리하고 DMAP으로 활성화 자극을 가하였을 때 분할율이 85.5%로 체외 수정한 대조군의 72.5%와 유사하였다. 그러나 ionomycin을 단독 처리하거나 ionomycin 처리 후 CHX로 활성화 자극을 가한 실험군의 분할율인 30.3와 57.9%에 비해 유의적 (P<0.05)으로 높게 나타났다. DMAP 처리군의 분할율은 대조군과 유사하였지만 배반포까지의 발달율은 12.3%로 대조군의 27.8%와는 유의적인 차이는 없으나 발달율이 낮은 경향으로 나타났다. 3. Ionomycin으로 처리 후 DMAP로 활성화 자극을 가한 실험군에서 난자의 발달속도는 활성화 자극 후 18시간 경과하였을 때 28%의 배분열율을 보여 분열속도가 가장 빨랐으며 활성화 자극 후 24~48시간동안 체외 배양을 하였을 때에도 ionomycin 단독 처리하거나 ionomycin 처리 후 CHX로 활성화 자극을 준 실험군에 비해 DMAP으로 활성화 자극을 가한 실험군이 유의적 (P<0.05)으로 빠른 발달속도를 보였다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제31권3호
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• pp.139-143
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• 2007

본 연구는 체세포를 이용하여 생산된 복제 한우 수소의 번식능력을 검토하기 위해 실시하였다. 복제 한우 수소(C-38 및 C-39) 또는 일반 한우 종모우로부터 정액을 채취하여 정자의 수 및 동결 전 후의 생존성 등을 살펴보았으며, 정자의 운동성 등은 computer assisted sperm analysis(CASA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 이들의 수정 능력을 확인하기 위하여 체외수정과 인공수정을 각각 실시하였다. 정액 성상에서는 복제 수소들과 일반 종모우 간에 정액의 양, 정자의 농도 및 동결융해 후의 생존성 등에서 차이가 나타나지 않았다. CASA를 이용한 분석에서 운동성, 곡선 운동 속도(VCL), 직선운동 속도(VSL) 및 평균 진행 속도(VAP) 등은 복제 수소의 정액이 일반 종모우의 정액에 비하여 유의적으로 높았다 (p<0.05).체외수정에 따른 수정란의 분화율 및 배반포로의 발달율은 복제 수소와 일반종모우 간에 차이가 나타나지 않았다. 복제소 정액(C-38)을 이용하여 인공수정을 한 5두의 체세포 복제 대리모에서 암 수 각각 한 두씩의 건강한 복제 후대 송아지 2두를 생산하였다. 이상의 결과를 종합하여 보면, 실험에 공시된 복제 수소 개체간의 차이가 나타나기는 하였지만, 복제 수소는 정액 성상과 정자의 운동성 등에서 일반 종모우와 차이가 없었으며, 또한 인공수정을 통해 송아지를 생산함으로써 정상적인 번식능력이 있음을 확인하였다.