LIM WOO JIN;RYU SUNG KEE;PARK SANG RYEOL;KIM MIN KEUN;AN CHANG LONG;HONG SU YOUNG;SHIN EUN CHULE;LEE JONG YEOUL;LIM YONG PYO;YUN HAN DAE
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제15권2호
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pp.302-309
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2005
Phytopathogenic Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) LY34 secretes multiple isozymes of the plant cell wall degrading enzyme endoglucanases. We have cloned a third cel gene encoding CMCase from Pcc LY34. The structural organization of the celC gene (AY188753) consisted of an open reading frame (ORP) of 1,116 bp encoding 371 amino acid residues with a signal peptide of 22 amino acids within the NH$_2$-terminal region of pre-CelC. The predicted amino acid sequence of CelC was similar to that of Peetobaeterium ehrysanthemi Cel8Y (AF282321). The CelC has the conserved region of the glycoside hydrolase family 8. The apparent molecular mass of CelC was calculated to be 39 kDa by CMC-SDS-PAGE. The cellulaseminus mutant of Pee LY34 was as virulent as the wild-type in pathogenicity tests on tubers of potato. The results suggest that the CelC of Pce LY34 is a minor factor for the pathogenesis of soft-rot.
선택적 리그닌 분해능을 가지고 생물펄프공정에 사용가능한 백색부후균을 얻기 위하여 94종류의 목재부후균을 검정하였고 선발된 7개종에 대하여 활엽수와 침엽수의 부후능력을 측정하였다. 우선 백색부후균은 셀룰로오즈 분해효소, 페놀산화효소, laccase, peroxidase 등의 효소활성을 간단한 방법으로 검정하여 선발하였는데, Bavendamm test에서 양성을 나타내는 대부분의 균들은 syringaldazine을 사용한 laccase test에서도 강한 반응을 나타낸 반면, 음성반응을 나타낸 대부분의 균들은 laccase와 peroxidase test에서도 음성반응을 나타내었다. 선택적 리그닌 분해능력을 지닌 부후균을 선발하기 위하여 부후균을 은사시나무와 일본잎갈나무(낙엽송) 목재블럭에 접종하여 12주간 배양한 후에 부후된 목재의 중량감소율, 리그닌 량의 감소, 형태적 변화들을 화학분석과 주사전자현미경을 통하여 분석하는 목재부후 실험을 실시하였다. 이 실험에서 사용한 거의 모든 균주는 목재블럭의 중량감소율이 일본잎갈나무 보다 은사시나무에서 2배이상 높게 나타났으며 균을 접종하지 않은 목재블럭에서는 중량감소가 전혀 나타나지 않았다. Ceriporiopsis subvermispora와 Phanerochaete chrysosporium이 다른 균주에 비해서 침엽수와 활엽수의 리그닌을 모두 잘 분해시키는 것으로 나타났으나 분해 능력은 Ceriporiopsis subvermispora가 더욱 우수하였다. Bjerkandera adusta와 미동정된 2균주는 은사시나무에서만 상대적으로 높은 리그닌 분해능력을 나타내었다. B. adusta는 모든 세포벽 성분을 동시에 분해시켜서 2차세포벽을 얇게 만들었으나 다른 균주들은 선택적 리그닌 분해력을 나타내어 두 세포의 세포벽 사이에 위치하는 중벽에 존재하는 리그닌을 분해시켜서 세포를 분리시키는 것이 관찰되었다.
만가닥버섯은 일본에서 가장 중요한 식용버섯이다. 그러나 배양기간이 약 85~120일로 길어서 국내에서 다른 버섯에 비해 배양이 어려운 실정이다. 이 연구에서는 만가닥버섯 표준유전체 염기서열분석을 위하여 '해미'품종으로부터 원형질체를 분리하고 재생하여 모균주의 단핵균주를 얻었다. MCM배지 및 MYG배지에서 배양되고, 균질화된 균사체는 원형질체를 얻기 위하여 Novozyme효소를 처리하였다. 원형질체 분리의 가장 높은 효율은 MCM 배지에서 이차배양이 3일된 균사체에 2.5시간 효소처리 조건이었다. 분리된 원형질체는 재생배지에서 2주 동안 배양되어 재생되었다. 재생체는 클램프로 단핵균주를 확인하고 '해미'의 모균주의 단핵균주와 클램프 유무로 친화성을 확인하였다. 분리된 모균주의 단핵균주는 짧은 배양기간을 가진 품종을 개발하기 위한 유전적 기초자료를 완성하는 표준유전체 염기분석 재료로서 사용될 예정이다.
밀 배아를 셀룰레이즈 활성이 있는 Celluclast 1.5L을 이용하여 다양한 시간 및 온도의 반응에서 생성되는 유기산(주석산, 젖산, 초산, 호박산)과 유리당(포도당, 설탕, 과당) 함량을 분석하였다. 또한 젖산, 초산, 호박산, 주석산으로 pH 4.5로 조정한 유기산 용액에서 Celluclast 1.5L과 밀 배아를 반응시켜 2,6-DMBQ의 함량에 미치는 영향을 평가하였다. 밀 배아에 대한 효소 반응 시간 및 온도가 증가함에 따라 주석산, 젖산, 초산, 호박산과 이들의 총유기산 함량은 증가하였다. 밀 배아 효소 반응 추출액의 설탕 농도는 효소 반응 시간이 증가할수록 지속적으로 감소한 반면에, 과당과 포도당의 농도는 효소 반응 시간이 길어짐에 따라 증가하였다. 유기산을 첨가한 Celluclast 1.5L 효소 추출 용액으로 반응시킨 밀 배아는 반응시간이 증가할수록 2,6-DMBQ 함량이 증가하는 경향을 보였지만, 대조군 대비 향상된 수치를 보이지 않았다. 향후 효소 처리 밀 배아 추출물을 활용한 다양한 생리활성에 대한 효능 평가와 더불어 효소 처리 밀 배아 추출물의 식품 소재화에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다.
내습성 및 감수성 선발계통 각 1점씩을 대상으로 침수처리 후 GO 분석을 통해 추출된 유전자들을 기능별로 분류해보면 생물학적 과정(biological process)에 관여하는 유전자 발현이 가장 크게 영향을 받았으며, 분자 기능(molecular function)과 세포 요소(cellular component) 관련 유전자를 포함하여 모든 기능의 유전자 발현 변화가 감수성 계통보다 내습성 계통에서 크게 일어났다. 침수처리 후 발현 양상이 유의하게 차이나는 유전자의 보다 자세한 기능을 측정한 결과 내습성 계통에서 발현량이 증가한 유전자는 CA02g26670은 CONSTANS protein과 관련있는 유전자로 일장조건에 따른 개화조절에 관여하는 유전자이며, 발현량이 감소한 유전자는 CA01g21450, CA01g22480, CA01g34470, CA02g00370, CA02g00380이었다. 감수성 계통에서 침수처리 후 발현량이 증가한 유전자는 CA02g09720, CA02g21290, CA03g16520, CA07g02110, CA12g17910이었는데 각각 단백질 분해효소 활성 저해, DNA binding, 세포벽 분해효소 억제, nodulin 관련 유전자 등으로 밝혀진 유전자들이었다. 감수성 계통에서 발현량이 감소한 유전자는 CA02g02820, CA03g21390, CA06g17700, CA07g18230로 각각 칼슘이온결합, 고온환경 발현기작, 레시틴 생합성 경로의 수용성중간대사체인 phosphocholine 합성 및 저온스트레스 관련 등의 기능을 한다. 내습성 계통과 감수성 계통에서 동시에 발현이 증가한 유전자는 고온 등 환경스트레스로 인한 apoptosis와 관련된 유전자와 peroxidase와 관련있는 유전자로 확인되었고, 발현이 동시에 감소한 유전자는 nucleoside transporter인 CA02g16990로 확인되었으며, 나머지 선발 유전자는 유전자 발현이 확인되지 않았다. 내습성 및 감수성 계통간 습해 조건에서 발현에 차이를 보이는 유전자 구명을 기반으로 향후 불량환경에 대해 저항성을 보이는 계통 육성 및 관련 생리반응에 대한 다양한 연구가 필요하다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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