• BMB Reports
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• 제43권8호
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• pp.541-546
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• 2010

We utilized a mammalian expression system to purify and characterize autotaxin (ATX)/lysophospholipase D, an enzyme present in the blood responsible for biosynthesis of lysophosphatidic acid. The human ATX cDNA encoding amino acids 29-915 was cloned downstream of a secretion signal of CD5. At the carboxyl terminus was a thrombin cleavage site followed by the constant domain (Fc) of IgG to facilitate protein purification. The ATX-Fc fusion protein was expressed in HEK293 cells and isolated from conditioned medium of a stable clone by affinity chromatography with Protein A sepharose followed by cleavage with thrombin. The untagged ATX protein was further purified to essential homogeneity by gel filtration chromatography with a yield of approximately 5 mg/liter medium. The purified ATX protein was enzymatically active and biologically functional, offering a useful tool for further biological and structural studies of this important enzyme.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권1호
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• pp.12-20
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• 2008

세포배양 유래 생물의약품 생산 공정에서 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. MVM은 동물 세포주와 동물 세포 배양 공정에 오염되는 대표적인 바이러스이다. 세포배양 유래 생물의약품의 MVM 안전성을 확보하기 위해, 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 MVM을 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 MVM 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 real-time PCR 시험법을 확립하였다. MVM에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 MVM DNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양 법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time PCR 민감도는 $6{\times}10^{-2}TCID_{50}/mL$이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성(specificity)과 재현성(reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 MVM을 오염시킨 CHO 세포에서 MVM검출 시험을 실시한 결과 MVM을 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 MVM을 정량적으로 검출할 수 있었다. 또한 바이러스 필터 공정에서 MVM제거 효과를 감염역가 시험법과 비교 검증한 결과 더 높은 민감도로 빠른 시간에 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 위와 같은 결과에서 확립된 MVM real-time PCR시험법은 생물의약품 안전성 보증을 위한 세포주 검증, 생물의약품 생산 공정 검증, 바이러스 제거 공정 검증 등에서 감염역가 시험법을 대신할 수 있는 신속하고, 특이성과 민감성이 우수한 시험법임을 확인하였다.

• 멤브레인
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• 제9권4호
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• pp.202-208
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• 1999

오일과 세척제가 다량함유되어 있는 자동차 세척배수를 한외여과막으로 처리하였다 세차배수 처리에 적절한 분리막과 투과현상을 평가하기 위하여 분획분자량이 10, 30 및 100k dalton인 한회여과막과 dead-end 방식의 stirred cell (Amicon 8050)을 사용하여 투과유고과 제거율을 측정하였다 분획분자량이 작은 막에 경우 막오염현상이 미약하였으나 분획분자량이 큰 YM100 (100k dalton)인 경우에는 분리막 표면에 오일층을 형성 뿐만 아니라 막 세공 중 일부는 운전압력 조건에 따라서 변형이 가능한 오일 입자가 막을 가능성이 있다 그러나 오일 및 입자 배제율 95% 이상이며 세척제를 포함한 투과수를 재활용할 수 있어 수질오염을 최소화할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 분획분자량이 50k dalton인 중공사형 한외여과막을 이용한 세차배수의 연속적 처리실험을 하였으며 케이크 여과모델이 잘 적용굄을 확인할수하였다.

• Archives of Pharmacal Research
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• 제27권2호
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• pp.217-224
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• 2004

Previously, we reported that water-extracted Acanthopanax senticasus exhibited anti-meta-static activity by stimulating the immune system. In this study, we fractionated glycoproteins (EN-SP) from the soluble protein layer (GF-AS) of A. senticasus and determined their basic chemical properties. We also investigated the anti-tumor and immunostimulating activities of the fractionated glycoprotein, EN-SP. We found that intravenous (i.v.) administration of GF-AS dramatically inhibited metastasis of colon26-M3.1 carcinoma cells to the lung in a dose-dependent manner. In vitro analysis showed GF-AS to enhance the proliferation of splenocytes. GF-AS also stimulated peritoneal macrophage, which was followed by the production of various cytokines such as IL-1$\beta$, TNF-$\alpha$, IL-12 and IFN-${\gamma}$. Furthermore, the production of these cytokines was partially blocked when peritoneal macrophage was cultured with the polyclonal antibodies against GF-AS. The depletion of NK cells by rabbit anti-asialo GM1 serum partly abolished the inhibitory effect of GF-AS on lung metastasis of colon26-M3.1 cells. Using gel filtration, EN-SP, an active glycoprotein fraction, is isolated from GF-AS. While both GF-AS and EN-SP stimulated the proliferatation of splenocytes of normal mice, EN-SP showed higher anti-metastatic activity and more potently stimulated the proliferation of splenocytes compared to GF-AS. These results suggest the use of EN-SP, the fractionated glycoprotein from A. senticasus, can be used as a therapeutical reagent to prevent or inhibit tumor metastasis.

• 대한수혈학회지
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• 제23권2호
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• pp.107-114
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• 2012

배경: 혈액제제 내에 혼입된 백혈구로 발생하는 부작용을 예방하기 위해서 백혈구필터를 이용한 백혈구의 제거가 널리 이용되고 있다. 그러나 상용 백혈구 필터로는 이식편대숙주병을 예방하기에는 충분한 백혈구제거가 되지 않아 고가의 기기를 이용한 방사선 조사를 시행하고 있는 실정이다. 한편 항체를 대체하는 압타머를 이용한 기술들이 활발히 개발되어 임상에 사용되기 시작하고 있다. 이에 백혈구에 결합하는 압타머를 이용한 압타머필터를 개발 하여 그 효율과 임상적용 가능성을 평가하고자 하였다. 방법: 포항공대 압타머사업단에 CD45항원에 결합하는 압타머 선별을 의뢰하여 제공받았으며 이를 비드에 부착시켜 백혈구와 결합하도록 한 후 자석을 이용해 제거하는 형식의 압타머필터를 개발하였다. 대한적십자사 혈액원에서 제공받은 백혈구제거적혈구 14단위에 압타머필터를 사용하여 잔여 백혈구를 제거한 후 백혈구 제거율과 적혈구 회수율, 세균배양을 시행하였다. 결과: 압타머필터 후 백혈구는 45.6%가 제거되었으며 92.8%의 적혈구회수율을 보였다. 세균배양에서는 아무것도 자라지 않았다. 결론: 압타머를 이용한 세포제거 기술을 혈액 필터에 적용하고자 CD45항원에 결합하는 압타머를 발굴하여 비드에 부착한 후 수혈 혈액을 필터링함으로써 해당 항원을 가진 세포 즉 백혈구를 제거하도록 하는 압타머필터를 개발하여 이를 평가하였다. 향후 압타머 부착 효율 및 필터과정 개선, 다른 항원에 대한 압타머 적용 등을 통해 혈액제제에서 백혈구 제거율을 높여 이식편대숙주병 예방을 위한 방사선조사를 대체하는 등 임상에 적용할 수 있을 것으로 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제22권4호
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• pp.552-558
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• 2012

사스(Severe acute respiratory syndrome, SARS)는 사람의 신종 폐렴인 중증 급성 호흡기 질환으로 신종 코로나바이러스, SARS-CoV에 의해 유발된다. 3CL protease는 SARS-CoV의 복제, 전사 및 단백질 합성을 조절하는 복제효소 복합단백질의 프로세싱에 결정적인 역할을 담당하는 중요한 효소이다. 따라서, 이 효소를 저해함으로써 SARS-CoV의 증식을 억제하고 사스의 증폭 및 확산을 막을 수 있다. SARS-3CL protease의 활성 저해물질의 탐색은 사스의 치료제 개발에 중요한 목표 중의 하나로 인식되고 있으며 이를 위해서는 활성형 SARS-3CL protease의 대량 생산이 필요하다. 본 연구에서는 활성형 SARS-3CL protease를 대량 생산하기 위하여 여러 가지 발현 벡터 및 단백질 발현 방법 등을 검토하였다. 그 결과, pET29a/3CLP 발현 벡터를 이용한 무세포 단백질 합성법이 SARS-3CL protease 생산에 최적 조건인 것으로 확인되었다. 또한 발현된 효소를 완전히 정제하여 그 특성을 분석한 결과, 본 효소는 무세포 단백질 합성계에서 전구체로 합성됨과 동시에 자가분해됨으로써 모든 단백질이 활성형인 성숙체 단백질로 전환되어 간단히 활성형 SARS-3CL protease 효소를 생산할 수 있음을 확인하였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제38권6호
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• pp.528-533
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• 1995

참비름 (Amaranthus mangostanus) 잎에서 단백질을 추출하여 S-Sepharose, Sephacryl S-200 HR, CM-Sepharose, Blue sepharose column chromatography에 의하여 단백질 합성 저해능이 있는 항바이러스성 단백질 (Amarnanthus antiviral protein, AAP29)을 분리하였다. 정제된 단백질의 분자량은 SDS-PAGE에서 약 29,200이었으며, 등전점은 9.0$50^{\circ}C$에서 20분간 처리한 경우에도 활성의 변화는 없었으며, 이 단백질의 단백질합성 저해능 활성을 in vitro translation system에서 측정한 결과 50% 저해농도 ($IC_{50}$)는 0.18 nM이었다. 담배잎 표면에 AAP29와 cucumber mosaic virus (CMV)를 함께 접종하여 항바이러스 활성을 생물검정한 결과 AAP29는 virus 감염를 현저히 저하시켰다. AAP29의 N-말단 아미노산 서열은 ADLTFTVTKDGTSQSYXTLXNXWRXW이었으며 기존에 알려진 다른 RIP과의 동질성은 없었다.

• Journal of Nutrition and Health
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• 제33권7호
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• pp.725-732
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• 2000

The purpose of this study was to investigate the effects of green tea catechin on renal dysfunction and blood presure change in chronic cadmium poisoned rats. Sprague-Dawley male rats weighing 100$\pm$10g were randomly assigned to one normal group and three cadmium poisoned groups. Cadmium groups were classified to catechin free diet(Cd-0C group) 0.25% catechin diet(Cd-0.25C group) and 0.5% catechin diet(Cd-0.5C group) according to the levels of catechin supplement. Animals were raids for 20weeks. Cadmium were supplied as drinking water of 50ppm Cd2+ Morphological changes shown through a light microscope and an electro-microscope revealed the mitochondria and tubule epithelial cell edema in Cd -0C group but they were alleviated in catechin supplementation. The urinary $\beta$2-microglobulin that measured to observe the glomerular injury were higher in Cd-poisoned groups than in normal group but they was lowered by catechin supplementation. Glomerular filtration ratios(GFR) in Cd-poisoned groups were significantly lower than in normal group but that of catechin supplementation group was similar to normal group. This suggested that catechin protected the kidney from the functional damage. Angiotensin converting enzyme(ACE) activity and blood pressure(BP) in Cd-poisoned groups were significantly higher than in normal group. Heart rate was tended to increase in Cd-poisoned groups. The results indicate that green tea catechin supplementation on chronic cadmium-poisoned rats normalized the renal dysfunction and blood pressure system.

• Environmental Engineering Research
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• 제17권4호
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• pp.185-190
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• 2012

Rejection characteristics of perchlorate ($ClO_4^-$) were examined for commercially available reverse osmosis (RO) and nanofiltration (NF) membranes. A bench-scale dead-end stirred-cell filtration system was employed to determine the toxic ion rejection and the membrane flux. Model water solutions were used to prepare $ClO_4^-$ solutions (approximately, $1,000{\mu}g/L$) in the presence of background salts (NaCl, $Na_2SO_4$, and $CaCl_2$) at various pH values (3.5, 7, and 9.5) and solution ionic strengths (0.001, 0.01, and 0.01 M NaCl) in the presence of natural organic matter (NOM). Rejection by the membranes increased with increasing solution pH owing to increasingly negative membrane charge. In addition, the rejection of the target ion by the membranes increased with increasing solution ionic strength. The rejection of $ClO_4^-$ was consistently higher for the RO membrane than for the NF membrane and $ClO_4^-$ rejection followed the order $CaCl_2$ < NaCl < $Na_2SO_4$ at conditions of constant pH and ionic strength for both the RO and NF membranes. The possible influence of NOM on $ClO_4^-$ rejection by the membranes was also explored.

• 대한미생물학회지
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• 제21권1호
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• pp.151-161
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• 1986

In order to develop sensitive and sepcific assay methods for E. coli heat labile enterotoxin(LT) hybridoma cell lines secreting LT specific monoclonal antibody were obtained. LT was purified from cell lysate of E. coli O15H11. The steps included disruption of bacteria by French pressure, DEAE Sephacel ion exchange chromatography, Sephadex G200 gel filtration, and second DEAE Sephacel ion exchange chromatography, successively. Spleen cells from Balb/c mice immunized with the purified LT and $HGPRT^{(-)}$ plasmacytomas, $P3{\times}63Ag8.V653$ were mixed and fused by 50% (w/v) PEG. Hybrid cells were grown in 308 wells out of 360 wells, and 13 wells out of them secreted antibodies reacting to LT. Among these hybridoma cell 1G8-1D1 cell line was selected since it had produced high-titered monoclonal antibody continuously. By using culture supernatant and ascites from 1G8-1D1 cells the monoclonal antibody was characterized, and an assay system for detecting enterotoxigenic E. coli was established by double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The following results were obtained. 1. Antibody titers of culture supernatant and ascites from 1G8-1D1 hybridoma cells were 512, and 102, 400, respectively by GM1-ELISA and its immunoglobulin class was IgM. 2. The maximum absorption ratio of 1G8-1D1 cell culture supernatant to LT was 90% at $300\;{\mu}g/ml$ of LT concentration. LT concentration shown at 50% absorption ratio was $103.45{\mu}g$ and the absorption ratio was decreased with tile reduction of LT concentration. This result suggests that monoclonal antibody from 1G8-1D1 hybridoma cell bound with LT specifically. 3. The reactivities of 1G8-1D1 cell culture supernatant to LT and V. cholerae enterotoxin(CT) were 0.886 and 0.142(O.D. at 492nm) measured by the GM1-ELISA, indicating 1G8-1D1 monoclonal antibody reacted specifically with LT but not with CT. 4. The addition of 0.1ml of ascites to 0.6mg and 0.12mg of LT decreased the vascular permeability factor to 41% and 44% respectively, but it did not completely neutralize LT. 5. By double sandwich ELISA using monoclonal antibody, as little as 75ng of the purified LT per ml could be detected. 6. The results by assay of detecting LT in culture supernatants of 14 wild strains E. coli isolated from diarrhea patients by the double sandwich ELISA were almost the same level as those by reverse passive latex agglutination.