• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권2호
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• pp.342-347
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• 2007

Bacteriophage ${\Phi}FC1$ integrase (MJ1) was previously shown to perform a site-specific recombination between a phage attachment site (attP) and a host attachment site (attB) in its host, Enterococcus faecalis, and also in a non-host bacterium, Escherichia coli. Here, we investigated biochemical features of MJ1 integrase. First, MJ1 integrase could perform in vitro recombination between attP and attB in the absence of additional factors. Second, MJ1 integrase interacted with att sites. Electrophoretic mobility shift assays and DNase I footprinting revealed that MJ1 integrase could efficiently bind to all the att sites and that MJ1 integrase recognized relatively short sequences (${\sim}50bp$) containing an overlapping region within attB and attP. These results demonstrate that MJ1 integrase indeed catalyzes an integrative recombination between attP and attB, the mechanism of which might be simple and unidirectional, as found in serine integrases.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제39권4호
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• pp.337-344
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• 2011

이전 연구에서, bacteriophage ${\Phi}FC1$이 Enterococcus faecalis KBL703에서 UV induction을 통해 분리 동정되었으며, ${\Phi}FC1$은 phage attachment site인 attP와 bacterial attachment site인 attB 사이에서 site-specific integration을 촉매하는 integrase를 가지고 있다는 것을 밝혀냈으며 이를 MJ1이라 명명하였다. 이 연구에서는 이를 바탕으로 MJ1에 의한 site-specific integration의 효율을 Escherichia coli와 NIH3T3 cell에서 확인 하기 위해 attP, attB, MJ1을 각각의 벡터에 삽입하였다. MJ1 인테그라제에 의한 재조합을 수행하기 위해서 기질 벡터 pABLP를 $DH5{\alpha}$에 형질전환시킨 후, LB 배지에서 $37^{\circ}C$ 1시간 배양한 후 암피실린(ampicillin)과 테트라싸이클린(tetracycline) 항생제 플레이트로 pGMJ1과 pABLP 같이 가지고 있는 colony 들을 선별하여, LacZ 유전자가 불활성화 된 흰색 콜로니 개수를 세고 통계를 낸 결과 integration의 frequency가 99% 이상인 것으로 나타났다. 또한, 실제로 재조합이 일어났는 지를 확인하기 위해서 콜로니 PCR을 수행하여 재조합의 산물인 attL 150 bp을 확인하였다. PCR 산물은 염기서열분석을 통해 정확한 site-specific integration이 일어났음을 확인하였다. MJ1에 의한 integration을 보이기 위해 attP와 attB를 가지고 있는 vector를 MJ1 expression vector와 함께 NIH3T3 cell에 cotransfection 했으며 GFP를 reporter로 사용해 그 activity를 관찰하였다. NIH3T3 cell에서 GFP의 발현을 형광 현미경을 통해 알아본 결과, MJ1에 의한 sitespecific integration이 다른 accessory protein의 도움 없이 일어난다는 것을 볼 수 있었다. 마찬가지 방법으로, attR과 attL 간의 excision을 GFP로 알아본 결과, GFP는 발현하지 않았으며, 이는 MJ1에 의한 excision이 일어나지 않았음을 보여주었다. 이와 같은 결과로 볼 때, MJ1의 host만이 아니라 넓은 범위안에서도 integration을 수행할 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서 MJ1을 이용한 site-specific integration system의 개발은 gene therapy를 위한 gene delivery system의 구축에 있어서 좋은 시작이 될 수 있다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제5권3호
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• pp.132-137
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• 1995

The lambda integrase (lnt) is believed to bind to several arm and core sites of attP DNA in order to facilitate intasome formation. We have done systematic mutagenic analysis on all 5 arm sites and found that P1 is absolutely required for integration while P2 is not. We also found that all 3 P' arm sites(P'1, P'2, and P'3) are required for efficient integrative recombination. P'1, which is an important binding site for excision, also seems to be crucial for integration when preincubation of attP DNA with Int and IHF is performed before recombination. Preincubation assay revealed that preincubation with Int and IHF improved the efficiency of recombination of wild type attP DNA and demolished recombinations of P'1 mutant attP DNAs.

• 미생물학회지
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• 제41권2호
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• pp.140-145
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• 2005

상업적으로 중요한 macrolide계 항진균 학생물질인 natamycin을 생산하는 Streptomyces natalensis ATCC27448의 환자 유전학적인 연구를 위해 대장균으로부터 S. natalensis로 plasmid DNA를 직접 도입하는 형질전환법을 확립하였다. 이러한 S. natalensis의 형질전환은 oriT와 attP 단편을 가지고 있는, ${\Phi}C31$ 유래의 integration 벡터인 pSET152를 이용하여 Escherichia coli ET12567/pUZ28002을 DNA 공여체(donor)로 이용한 접합전달법(conjugal transfer)을 사용하여 확립하였다. 접합전달의 가장 높은 효율은 10 mM의 $MgCl_2$를 포함한 MS 배지에서, $6.25\times10^8$의 E. coli 공여체와 열처리를 하지 않은 S. natalensis의 포자를 사용하여 얻어졌다. 또 얻어진 접합전달체 (exconjugant)에 대하여 southern blot hybridization과 벡터가 삽입된 염색체부분의 염기서열분석을 통해 attB site와 pseudo-attB site를 확인하다. attB site의 경우에는 다른 방선균들처럼 S. natalensis 염색체의 pirin 상동체를 코드하는 ORF내에 존재하였으나 pseudo-attB site는 염색체내 다른 site (GenBank accession no. $YP\_117731$)에 존재하였고 그 염기서열은 attB 염기서열과 차이를 나타내었다.

• 대한영상의학회지
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• 제82권3호
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• pp.626-637
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• 2021

목적 만성 뇌동맥 협착-폐색증에서 아세타졸아미드 부하 다상 동맥 스핀 표지(multi-phase arterial spin labeling; 이하 MP-ASL) 자기공명관류영상을 이용하여 뇌혈류 예비능(cerebrovascular reservoir; 이하 CVR)과 동맥 통과 시간(arterial transit time; 이하 ATT)의 변화를 탐색하였다. 대상과 방법 2019년 6월부터 2020년 10월까지 새롭게 만성 협착-폐색증으로 진단되어 아세타졸아미드 부하 MP-ASL을 시행한 환자를 후향적으로 모집하였다. 부하 전후의 뇌혈류(cerebral blood flow), CVR, 부하전 ATT 및 부하 전후의 ATT 변화량을 중증 협착과 완전 폐색간, 만성 뇌경색 병변의 유무에 따라 비교하였다. 결과 5명의 양측성 협착-폐색을 포함하여 총 32명의 환자가 본 연구에 포함되었다. CVR은 완전 폐색에서 중증 협착보다 유의하게 낮았다(26.2% ± 28.8% vs. 41.4% ± 34.1%, p = 0.004). ATT의 변화는 두 군간 유의한 차이는 없었다(p = 0.717). 만성 뇌경색 병변의 유무에 따른 CVR의 통계적 차이는 미미하였다(29.6% ± 39.1% vs. 38.9% ± 28.7%, p = 0.076). 하지만, 만성 뇌경색 병변이 있는 환자에서 ATT의 단축 정도는 유의하게 작았다(-54 ± 135 vs. -117 ± 128 ms, p = 0.013). 결론 만성 협착-폐색증에서 아세타졸아미드 부하 MP-ASL 검사는 MRI 기반의 CVR 평가 도구로 사용될 수 있다.

• 한국양식학회지
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• 제10권2호
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• pp.143-151
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• 1997

본 연구는 조피볼락 사료에 있어서 어분대체품을 결정하고, 상품어분대체품과 유인물질의 첨가 효과를 통하여 조피볼락용 어분대체품개발을 위한 기초자료도 사용하고자 수행되었다. 실험사료는 조단백질 52%로, 가용성 에너지 16.8 KJ/g으로 설계되었고, 주단백질원으로 북양어분, 어분대체품 및 상품어분대체품을 사용하였다. 사료의 성분조성은 다음과 같이 요약된다 : 사료1, 100%FM (control) ; 사료2, 60%FM : 40% CFMA ; 사료3, 60%FM : 40% CFMA+ATT ; 사료 4, 80%FM : 20% FMA ; 사료5, 80% FM: 20%FMA+ATT : 사료 6, ; 사료6, 60%FM : 40%FMA+ATT; 사료7, 40%FM : 60% FMA+ATT. 어분대체품은 혈분(BM), 오징어간분(SLP), 육골분(MBM), 수지박(LM), 가금부산물(PBP), 우모분(FM), 필수아미노산(Met, Lys, Ile) 등을 적절히 배합하여 제작 사용하였다. 성장률, 사료효율, 일간성장률 및 단백질효율에 있어서 사료 1은 사료 4, 사료 5 및 사료 6에 비해 유의적인 차이가 없었지만(P>0.05), 나머지 실험구들은 대조구에 비해 유의적으로 낮게 나타났다(P<0.05). 특히, 상품어분대체품(CFMA)인 사료 2와 사료 3은 실험사료로 제작된 동일한 수준의 사료 6과 비교하여 성장률, 사료효율, 단백질효율에서 유의적으로 낮은 경향을 보였다. 0.5% 유인물질을 첨가한 사료 3과 5는 사료 2와 4에 비해 유의적인 차이는 보이지 않았으며(P>0.05), 간중량지수, hemoglobin 및 비만도에 있어서는 유의적인 차이가 나타났다(P<0.05). 따라서, 조피볼락에 있어서 어분대체품(FMA)으로 어분단백질을 40%정도 대체 가능함을 알 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제13권5호
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• pp.783-788
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• 2003

A 27 bp $tRNA^{Gly}$ region (att1) was identified as the integration site for a 12,384 bp Pfl-derived genomic island containing 15 open reading frames (ORFs) from PA0715 to PA0729 in P. aeruginosa strain PAOl. Homologous island was observed in P. aeruginosa strain PA14, but not in P. aeruginosa strain K (PAK). We isolated the Pfl island from PA14, and determined its 10,657 bp sequences containing 14 ORFs, with significant sequence variations near the borders. In contrast to the PAO1 Pfl island, the PA14 Pfl island was integrated at the 10 bp att2 site between PA1191 and PA1192. The attl site of PA14, however, was still occupied by a third genetic segment, whereas both attl and att2 sites of PAK remained unutilized. These results exemplify an extensive genomic variation of Pfl-related islands involving differential genetic organizations and differential att site utilizations.

• KSBB Journal
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• 제25권2호
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• pp.167-172
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• 2010

농작물에 심각한 피해를 주는 phytotoxin을 생산하는 S. scabiei ATCC 49173의 분자 유전학적인 연구를 위해 대장균으로부터 S. scabiei로 plasmid DNA를 도입하는 접합 전달법을 이용한 형질전환법을 확립하였다. 본 연구를 통해 확인된 S. scabiei의 접합전달용 최적배지는 50 mM의 $MgCl_2$를 첨가한 MS배지이며 접합전달에 사용되는 DNA 수용체인 포자는 $45^{\circ}C$의 열처리와 $5{\times}10^7$이상의 plasmid DNA 공여체가 필요하다는 것을 확인하였다. 또 얻어진 접합전달체에 대하여 Southern blot hybridization과 벡터가 삽입된 염색체부분의 염기서열분석을 통해 attB site의 특성을 분석한 결과 S. scabiei 염색체의 pirin 상동체를 코드하는 ORF내에 단일위치로 존재하고 있으며 이미 밝혀진 다른 방선균유래 attB site의 염기서열에 대해 86.3%~96.1%의 상동성을 보였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권4호
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• pp.535-538
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• 2000

Streptomyces lavendulae FRI-5 produces the ${\gamma}$-butyrolactone autoregulator IM-2, which is required for nucleoside antibiotic producetion. We have developed a system for introducing DNA into S. lavendule FRI-5 via conjugal transfer from Esherichia cole. Conditions were established for conjugation of the oriT-and attP-containing plasmid pSET152 from E. coli ET12567 (pUZ8002) to FRI-5. Conjugation resulted in integration of the plasmid at the chromosomal C31 attB site. The frequency of intergeneric conjugation varied with the medium used. The highest frequency ($1.6\times10-5$ per recipient) was obtained on ISP medium 2 containing 10mM MgCl2. Southern blot and phenotypic analyses of exconjugants revealed that S. lavendulae FRI-5 contains a unique C31 attB site, and that integration of heterologous DNA into the attB site did not interfere with morphological differentiation or IM-2-dependent signal transduction, including the production of a blue pigment. This system will now enable detailed genetic analysis of the regulation of antibiotic production in S. lavendulae FRI-5.

• Annals of Laboratory Medicine
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• 제38권6호
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• pp.591-598
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• 2018

Background: Forkhead box P3 (FOXP3) is an important marker of regulatory T cells. FOXP3 polymorphisms are associated with autoimmune diseases, cancers, and allograft outcomes. We examined whether single nucleotide polymorphisms (SNPs) at the FOXP3 locus are associated with clinical outcomes after allogenic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Methods: Five FOXP3 SNPs (rs5902434, rs3761549, rs3761548, rs2232365, and rs2280883) were analyzed by PCR-sequencing of 172 DNA samples from allogenic HSCT patients. We examined the relationship between each SNP and the occurrence of graft-versus-host disease (GVHD), post-HSCT infection, relapse, and patient survival. Results: Patients with acute GVHD (grades II-IV) showed higher frequencies of the rs3761549 T/T genotype, rs5902434 ATT/ATT genotype, and rs2232365 G/G genotype than did patients without acute GVHD (P =0.017, odds ratio [OR]=5.3; P =0.031, OR=2.4; and P =0.023, OR=2.6, respectively). Multivariate analysis showed that the TT genotype of rs3761549 was an independent risk factor for occurrence of acute GVHD (P =0.032, hazard ratio=5.6). In contrast, the genotype frequencies of rs3761549 T/T, rs5902434 ATT/ATT, and rs2232365 G/G were lower in patients with post-HSCT infection than in patients without infection (P =0.026, P =0.046, and P =0.031, respectively). Conclusions: rs3761549, rs5902434, and rs2232365 are associated with an increased risk of acute GVHD and decreased risk of post-HSCT infection.