• 한국응용과학기술학회지
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• 제33권1호
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• pp.143-154
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• 2016

본 연구는 달팽이육질을 2차 발효공정을 통하여 얻어진 추출물을 개발하여, 피부미용학적 항노화 활성에 관한 것이다. 1차 발효물을 얻기 위하여 노루궁뎅이버섯균사체로 배양하였으며, 2차 유산균 발효공정을 통하여 2차 발효달팽이 추출물을 얻는 과정에 대하여 상세히 기술하였다. 이 연구에 적용된 균사체는 노루궁뎅이버섯균사체 (Hericium erinaceum Mycelium)와 유산균 (Leuconostoc mesenteroides) 발효균을 사용하여 추출하였다. 추출물의 최종 수율은 62wt%이었다. 2차 발효된 달팽이 추출물의 수분 32wt%, 아미노산 단백질류 31.5wt%, 다당체 15.7wt%, 지방산 12.3wt%, 기타성분이 8.5wt%가 함유하였다. 또한 피부미용학적 이론과 피부의 항노화에 관여하는지를 알아보기 위하여 DPPH에의한 항산화 활성, 엘라스틴의 효소(elastase)감소효과, tyrosinase저해율, fibroblast의 성장율, 콜라겐합성률에 대하여 평가한 결과를 하기와 같이 보고한다. 첫째; 2차 발효달팽이 추출물의 항산화 효과(DPPH, IC50%)는 7.27 mg/mL로, 비교군인 녹차추출물 11.8 mg/mL, 일반달팽이추출물 15.7 mg/mL, DL-a-토코페롤 9.25 mg/mL가 소요되었다. 둘째; 2차발효달팽이추출물의 엘라스틴 효소(elastase)의 발현억제능(IC50%)은 32.5 mg/mL로 비교군인 녹차추출물 45.9 mg/mL, 일반 달팽이추출물 67.7 mg/mL가 소요되었다. 셋째; 2차 발효달팽이 추출물의 tyrosinase의 발현억제능(IC50%)은 140.3 mg/mL로 비교군인 녹차추출물 250.7 mg/mL, 일반달팽이추출물 389.5 mg/mL, 니아신아마이드 125.9 mg/mL가 소요되었다. 넷째; 2차 발효달팽이 추출물의 fibroblast의 성장률은 125.6%로 비교군인 녹차추출물 98.9%, 일반 달팽이추출물 109.5%, DL-a-토코페롤 96.2%의 활성력을 보였다. 다섯째; 2차 발효달팽이 추출물의 collagen생합성률은 118%로 비교군인 녹차추출물 87.3%, 일반달팽이추출물 93.2%, 아데노신 127.9%의 성장률을 보였다. 결론적으로 이 연구를 바탕으로 하여 미래에는 피부미용학적 활용과 더불어 한국적 스킨케어 화장료 개발에 응용이 가능할 것으로 기대한다.

• 한국식품저장유통학회지
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• 제19권4호
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• pp.586-593
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• 2012

오가피열매 추출물의 다양한 생리활성을 측정하였다. 오가피열매 추출물의 페놀성물질 함량은 열수 추출물과 60% ethanol 추출물에서 각각 21.4, 15.8 mg/g으로 측정되었으며, 항산화효과 측정에서는 200 ${\mu}g/mL$ 농도의 페놀성 화합물이 첨가되었을 때 DPPH에 대한 전자공여능은 열수 추출물에서는 $92.4{\pm}0.1%$, 60% ethanol 추출물에서는 $89.2{\pm}1.1%$로 측정되었다. $ABTS^+$ radical decolorlization에서는 열수 추출물은 $98.3{\pm}1.1%$, 60% ethanol 추출물은 $96.5{\pm}3.5%$로 측정되었고, antioxidant protection factor측정 결과, 열수 추출물은 $2.0{\pm}0.6$ PF, 60% ethanol 추출물은 $1.2{\pm}2.8$ PF로 측정되었다. TBARs 측정에서는 열수 추출물이 $66.3{\pm}0.8%$, 60% ethanol 추출물이 $61.4{\pm}2.3%$의 저해능을 나타내었다. Angiotensin converting enzyme (ACE)과 xanthine oxidase (XOase) 저해능은 200 ${\mu}g/mL$ 농도의 페놀성 화합물이 첨가 되었을 때 열수 추출물에서 ACE가 $59.3{\pm}1.5%$의 저해능을 나타내었고, 에탄올 추출물에서 ACE가 $85.1{\pm}3.2%$, XOase 가 $9.52{\pm}0.8%$의 저해능을 가지는 것으로 확인되었다. 오가피열매 추출물의 tyrosinase 억제효과는 열수 추출물에서 $56.6{\pm}1.8%$, 60% ethanol 추출물에서 $33.7{\pm}2.2%$의 저해능을 나타내었고, elastase의 경우 열수 추출물과 60% ethanol 추출물에서 각각 $53.1{\pm}1.1%$와$22.4{\pm}3.1%$의 저해능을 나타내었다. Astringent 효과는 열수 추출물에서 $50.5{\pm}0.9%$, 60% ethanol 추출물에서 $11.5{\pm}4.1%$의 효과를 가지는 것으로 확인되었다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제34권4호
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• pp.388-395
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• 2019

본 연구에서는 고지방 및 고콜레스테롤 식이 흰쥐에 셀레늄 강화 시금치를 공급하여 간 조직의 항산화방어계와 지질과산화에 미치는 영향을 관찰하였다. 실험동물은 체중 $150{\pm}10g$ 내외의 Sprague-Dawley종 수컷 흰쥐를 사용하였으며, 정상식이 대조군(N), 고지방 및 고콜레스테롤 공급군(HF), 고지방 및 고콜레스테롤 공급군에 무처리 시금치 5% 공급군(SPA) 및 10% 공급군(SPB), 고지방 및 고콜레스테롤 공급군에 셀레늄 강화 처리 시금치 5% 공급군(SSA) 및 10% 공급군(SSB)으로 총 6군으로 나누었다. 식이 및 식수는 자유섭취하게 하였으며 4주간 사육한 후희생시켰다. 간 조직 중의 항산화 효소계인 SOD 활성은 HF군에 비해 셀레늄 시금치 공급군 SSA 및 SSB군에서 각각 31.4% 및 36.9% 증가하였으나 유의적인 차이는 아니였다. GSH-px 활성은 또한 SSA 및 SSB군에서 각각 5.8% 및 12.2% 증가하였으나 유의적인 차이를 나타내지 않았고, catalase 함량은 전체 군에서 유의적인 차이를 볼 수 없었다. 유리기를 소거하는 지표인 간 조직의 superoxide radical 함량은 microsome에서 정상군에 비해 HF군에서 86.7%의 유의적인 증가를 나타내었으나 10%의 셀레늄 강화 시금치를 공급한 SSB군에서는 HF군에 비해 54.8%로 유의적으로 감소하였다. 간 조직의 microsome에서의 산화단백질 함량은 정상군에 비해 HF 군에서 60.5%로 유의적으로 증가 되었으나 시금치의 공급으로 유의적으로 감소하였다. Mitochondria에서는 정상군에 비해 유의적으로 증가된 HF군의 carbonyl value 함량이 셀레늄 강화 시금치를 10% 공급한 SSB군에서 23.1%로 유의적으로 감소하였다. 과산화지질의 함량을 적혈구에서 관찰한 결과 정상군에 비해 HF 군에서 59.0%로 유의적으로 증가하였고 10% 무처리 시금치 공급군 및 10% 셀레늄 강화 공급군에서는 각각 유의적으로 감소하였다. 과산화지질의 함량을 간 조직에서 관찰 한 결과, 정상군에 비해 HF군에서 42.6%로 유의적으로 증가하였고, 또한 고지방 및 고콜레스테롤 식이로 인해 증가된 과산화지질은 시금치를 공급한 모든 군에서 유의적인 감소를 나타내었다. 특히 무처리 시금치 군에 비해 셀레늄 강화 시금치에서 유의적으로 더 높은 과산화지질이 감소하였다. 이러한 결과는 시금치에 함유된 여러 항산화 성분이 효과적으로 활성산소종의 소거에 관여함으로써 산화적 손상을 완화시킨 결과로 보이며, 특히 시금치에 셀레늄의 처리는 항산화능의 상승효과에 기여했으리라 사료된다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제44권4호
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• pp.540-548
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• 2015

본 연구에서는 김치에서 분리한 Bacillus subtilis KMKW4를 이용하여 백미 및 아마란스를 영양원으로 발효하였으며 발효물의 배양 특성과 항산화 활성 및 생리활성을 조사하였다. 백미와 아마란스의 비율별로 제조한 발효물 중 아마란스 20%가 첨가된 R80의 생균수가 가장 높았고 pH 또한 낮아 발효가 잘 진행되었음을 확인하였다. 발효물의 amylase 활성을 측정한 결과 R100, R90, R80, R70 중 R80에서 48시간 배양 시 57.77 unit/mL로 가장 높아 R80을 곡류 효소 함유 제품 개발을 위한 혼합조건으로 선정하였다. 발효물의 동결건조분말에 대한 amylase 활성도 발효물과 동일하게 48시간에서 가장 높게 나타나 동결건조 후에도 효소 활성이 유지되는 것을 확인하였다. 발효물 동결건조분말의 유리당 함량은 발효 후 R80에서 maltose는 검출되지 않았으며, glucose는 5,454.2 mg/100 g으로 함량이 증가하였고 R100보다 높음을 확인하였다. 유리아미노산 함량은 R100의 경우 발효 전 664.9 mg/100 g에서 48시간 발효 후 834.2 mg/100 g으로 증가하였으며, R80은 발효 전 868.8 mg/100 g에서 발효 후 1,085.2 mg/100 g으로 증가하였다. 항산화 활성은 발효함에 따라 증가하였으며 R100보다 R80에서 우수하였다. ACE 저해 활성은 발효 전 R100과 R80에서 각각 30.12%와 40.22%로 나타났으며 발효 후에는 각각 59.13%와 78.57%로 나타나 발효가 진행됨에 따라 증가하는 경향을 보였고 R80이 R100보다 더 높은 ACE 저해 활성을 나타내었다. ${\alpha}$-Glucosidase 저해 활성은 모든 실험군에서 발효 전보다 발효 후에 높은 저해 활성을 나타내었으며, R100보다 R80이 우수하여 향후 곡류 효소 함유 식품 제조를 위한 소재로 활용 가능하다고 사료된다.

• Applied Microscopy
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• 제39권4호
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• pp.311-317
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• 2009

본 연구는 투어마린 소재와 전기적인 방전을 통해 물의 성질을 변화시킨 투어마린이온활성수를 이용하여 간보호 효과, 비만 예방 효과, 숙취제거 효과를 확인하기 위해 시행되었다. 고지방식이로 비만을 유도한 ICR 마우스에서 투어마린이온활성수를 급이한 실험군은 정수물을 급이한 대조군과 비교하여 사료섭취량이 비슷하고 음수량이 더 적었지만 체중증가는 대조군에 비하여 억제되어 13주에는 유의한 차이를 보여줌으로써 비만 예방 효과를 나타내었다(P<0.05). 사염화탄소로 간독성을 유발시킨 생쥐를 이용하여 간보호 효과를 관찰한 실험에서, 실험군의 aspartate aminotransferase (AST)와 alanine aminotransferase (ALT)는 대조군과 비교하여 평균적인 차이를 나타내었으며, 간의 조직학적 관찰에서 괴사를 비롯한 병리학적 병변이 감소한 것으로 나타났다. S-D rats을 이용한 숙취 실험에서는 실험군이 대조군에 비해 혈중알콜농도가 유의하게 낮았으며(P<0.01), 알콜 대사와 관련된 항산화 효소인 glutathione-S transferase (GST)는 활성이 증가한 것으로 관찰되었고(P<0.05), 간기능 지표인 AST와 ALT는 상대적인 감소현상을 보였다. 이와 같은 결과는 투어마린이온활성수의 음용이 동물의 항산화 체계에 영향을 미침으로써 간조직을 보호하고 알콜 분해를 향상시킨 것으로 판단되며, 그 결과 숙취해소에 어느 정도 효과가 있을 것으로 판단된다. 투어마린이온활성수의 효능과 관련된 기전은 아직 과학적 검증에 어려움이 있으나, 물에 전달된 투어마린의 원적외선에너지나 전기적 영향으로 인하여 물분자의 결합력과 분자 구조 또는 클러스터의 크기에 변화를 일으켰기 때문으로 판단된다. 사용된 투어마린이온활성수는 음용안전성이 확보된 물로서 효과적인 기능수로 개발될 가능성을 가지며, 유효성과 관련된 기전은 더 연구될 필요성이 있다.

• Radiation Oncology Journal
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• 제24권4호
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• pp.272-279
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• 2006

목 적: 항산화 효소인 peroxiredoxin (Prx) I과 II가 유해자극에 의해서 유발되는 세포내 반응성 산소족(reactive oxygen species, ROS)에 대한 방어기전에 관여하는지 알아보고자 이 연구를 시행하였다. 대상 및 방법: SK-N-BE2C (신경아세포종세포)와 Rat2 (섬유모세포)에서 PrxI과 PrxII 발현을 보기 위하여 방사선조사, cisplatin 단독투여 및 cisplatin-방사선조사병합투여 후에 PrxI과 PrxII에 대한 western blot을 시행하였다. 또한 N-acetyl-L-cysteine (NAC)에 의하여 PrxI과 PrxII 발현에 미치는 영향과 세포생존율을 함께 조사하였다. 두 종류 세포에 방사선조사, 다양한 농도의 cisplatin을 단독투여 및 방사선조사와 병합투여 시 생존율을 각각 분석하였고 SK-N-BE2C의 각 군에서 시간별 생존율을 관찰하였다. 결 과: PrxI의 발현은 SK-N-BE2C에서 방사선조사 후 60분까지 증가하였으나 NAC 전처치한 경우 방사선조사 후 60분에서는 대조군에 비하여 약간 증가하였다. Rat2에서는 방사선조사 후 NAC 전처치 여부에 관계없이 증가하지 않았다. PrxII의 발현은 두 가지 세포 모두에서 방사선조사와 NAC 전처치 여부에 관계없이 증가하지 않았다. SK-N-BE2C와 Rat2에서 다양한 농도의 cisplatin 단독투여나 cisplatin-방사선조사병합시에는 PrxI 및 PrxII의 발현은 증가하지 않았다. SK-N-BE2C와 Rat2에서 NAC 전처치 여부에 따른 방사선조사군 및 cisplatin-방사선조사병합군의 생존율을 각각 비교한 결과 PrxI의 발현이 증가되었고, NAC 전처치하였으며 cisplatin의 농도가 낮을수록 유의하게 생존율이 높았다. SK-N-BE2C에서 NAC를 전처치한 방사선조사군의 생존율이 NAC 전처치 안한 방사선조사군에 비하여 높은 경향만 보였으나, Rat2에서는 유의한 차이로 NAC를 전처치한 방사선조사군의 생존율이 높았다. SK-N-BE2C에서 시간별 생존율을 측정한 결과는 방사선조사군과 cisplatin-방사선조사병합군을 비교하면 방사선조사군이 빠른 세포생존율의 감소를 보였으며 12시간 때에 최대의 차이를 보였으나 48시간에서는 cisplatin-방사선조사병합군의 세포생존율이 유의하게 낮았다. 결 론: 방사선조사로 반응성 산소족이 증가되면 PrxI 발현이 증가되었으며 반응성 산소족 청소제인 NAC의 전처치에 의하여 PrxI의 발현이 감소되었다. Cisplatin은 PrxI의 발현을 억제하여 반응성 산소족에 의한 세포손상을 증가시키며 방사선으로 인한 세포치사효과를 증가시켰다고 판단된다. 이상의 결과로 PrxI의 발현여부가 방사선조사나 cisplatin의 세포치사기전에 부분적으로 관여하고 있을 것이라고 생각한다.

• Journal of Nutrition and Health
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• 제48권1호
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• pp.9-18
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• 2015

본 연구에는 최근 항비만 소재로 연구되고 있는 건조, 미숙탱자의 물 추출물 (PF-W) 소재를 대상으로 폴리페놀 ($52.15{\pm}4.02mg/g$)과 플라보노이드 ($6.56{\pm}0.47mg/g$) 함량을 측정하고 항산화 활성과 세포독성을 시험한 후, 지방 흡수 제어 가능성을 확인하고자 lipoprotein lipase (LPL)의 억제효능을 배양배지와 세포 내의 LPL 함량, LPL mRNA 발현 그리고 LPL 효소활성측정을 통해 검토하였다. 그 결과 PF-W은 3T3-L1 adipocyte에서 LPL mRNA의 발현과 활성에는 영향이 없었으며, LPL의 분비를 억제하는 것을 알 수 있었다. PF-W의 LPL 분비억제기작을 확인하기 위해 다양한 단백질 이동 관련 유전자의 발현을 확인하였고, 그 결과 LPL의 이동과 분해에 관여하여 세포내 LPL의 활성을 조절하는 것으로 알려진 SorLA의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 조절하는 transcription factor의 발현과 세포핵으로의 이동에 PF-W가 미치는 영향을 검토한 결과 PF-W를 처리함으로써 SorLA promoter 에 작용하는 $C/EBP{\beta}$의 단백질양이 세포핵에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 PF-W가 SorLA 유전자의 transcription factor인 $C/EBP{\beta}$의 단백질 발현을 세포핵에서 증가시킴으로써 SorLA의 발현이 증가되어 LPL의 분비억제가 가능함을 확인할 수 있었으며 이는 PF-W의 항비만 효과기전을 설명하는 기초자료를 제공하는 것이라 사료된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제14권2호
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• pp.99-105
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• 2010

정세관은 매우 복잡한 조직으로 마우스의 정자 발생 과정은 12단계로 구성되어 있다. Glutathione peroxidase(GPx)는 glutathione을 이용하여 과산화물(hydroperoxide)을 환원시키는 대표적인 항산화효소로서 포유류 정자 발생 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 laser capture microdissection(LCM)을 이용하여 마우스 정소에서 발생 단계별로 정세관을 채취하여 real-time PCR로 cytosolic GPx(cGPx), gastrointestinal GPx(GI-GPx), plasma GPx(pGPx) 및 phospholipid hydroperoxide GPx(PHGPx)와 같은 GPx family 유전자의 발현 정도를 비교분석하였다. 동결절편(10 ${\mu}m$)은 정상 성숙 마우스의 정소를 사용하였다. LCM 방법으로 정세관의 단면을 I~V, VII~VIII, IX~XI 단계로 구별하여 채취하였다. PHGPx mRNA의 발현은 다른 GPx mRNA보다 정소에서 현저하게 높게 발현되었다. 정자 발생 단계에서 GI-GPx, pGPx 및 PHGPx의 mRNA는 VII~VIII 단계에서 가장 높았고 XI 단계 이후에 감소되었으며, I~V 단계에서 가장 낮은 발현을 보였다. 그러나, cGPx mRNA는 VII~VIII 단계에서 가장 높았고, XI~XI 단계에서 가장 낮은 발현을 보였다. 본 연구 결과, GPx family 유전자는 정자 발생 단계에서 서로 다르게 조절되며, LCM 방법은 정소세포의 정량 분석에서 유용하게 사용될 것으로 사료된다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제57권1호
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• pp.7-15
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• 2014

본 연구에서는 고지방식이로 비만을 유도한 마우스를 이용하여 비지 (SCR)와 Monascus pilosus로 발효비지의 항비만 및 항산화 효능을 조사하였다. 마우스는 비지와 발효비지를 2% (wt/wt)가 되도록 고지방식이에 첨가하여 8주간 사육하였다. 비지 및 발효비지 투여군은 고지방식이 대조군과 비교할 때 모두 유의한 수준의 체중 감량, 체중 증가율, 부고환주변의 지방 함량이 낮았다. 8주째의 초기체중에 대한 체중증가율은 정상식이군 19.54%, 고지방식이군 45.40%, 비지군 33.39% 그리고 발효비지군 31.42%로 발효비지군에서 가장 낮았다. 또한 혈청의 triglyceride, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 함량 그리고 간 조직의 trigrlyceride 함량도 고지방식이로 증가된 수준에서 크게 줄어들었다. 한편 비지와 발효비지의 급여는 glutathione 함량을 높이고, 지질의 과산화, 혈청의 aminotransferase 및 xanthine oxidase의 활성을 낮추는 것으로 나타났다. 반면, superoxide dismutase, glutathione S-transferase, glutathione peroxidase의 활성은 비지 및 발효비지군 모두에서 고지방식이군에 비하여 높았다. 마지막으로, 비지군과 비교할 때 발효비지군은 고지방식이로 비만을 유도한 마우스에서 비정상적인 비만 관련 생화학적 지표들을 좀 더 효과적으로 정상식이군의 지표들로 회복시켜주는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과, 고지방 식이로 인한 체중 증가와 복부지방의 축적 및 고지혈증과 간 조직의 지방 축적현상이 M. pilosus로 발효시킨 비지의 2% 식이로 항비만 효과와 동시에 혈액 및 간 조직 지방의 함량을 저하시켜 고지혈증으로 인해 야기될 수 있는 심혈관계 질환을 예방할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 활성산소 생성계의 활성 억제와 활성산소 소거계 활성 증가를 유도함으로서 비만 상태에서 나타날 수 있는 과잉의 활성산소에 의한 간 조직 손상을 예방 혹은 경감시켜줄 수 있을 것으로 사료된다.

• 동아시아식생활학회지
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• 제20권1호
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• pp.20-29
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• 2010

본 연구에서는 항고지혈, 항당뇨, 항동맥경화 등의 기능성이 잘 알려진 naringin을 이용하여 빛, 열, 산소 등의 산화환경을 개선시킴으로써 지질대사 개선에 대한 유용성이 증가되는지를 알아보고자 하였다. 즉, 불안정한 naringin 등의 flavonoid를 cyclodextrin 분자의 소수성 공동에 포접시켜 안정성을 증가시킴으로써 지질대사가 naringin 단독 보충에 비해 개선되는지를 분석하고, 이 연구 결과를 토대로 건강 기능식품에 적용 가능한지에 대한 여부를 검토하고자 하였다. 이에 20% 고지방식이에 0.02% naringin 및 naringin이 0.02% 첨가되도록 CD-naringin 량을 조절하여 10주간 C57BL/6 mice에 보충한 결과, 체중 및 식이 섭취량에는 차이가 없었으나, HFC 군에 비해 CD-N군 및 N군에서 백색지방 무게가 유의적으로 감소되었다. 뿐만 아니라, CD-N군 및 N군에서 혈장 총콜레스테롤, 유리지방산, 혈당 및 간 조직 콜레스테롤과 중성지방 농도가 HFC군에 비해 유의적으로 감소하였고, 혈장 HDL-콜레스테롤 농도는 유의적으로 증가하였다. 혈장 및 간조직 지질 농도는 간 조직 지질대사 관련 효소 활성도와 일치하는 경향을 보여주었는데, CD-naringin 및 naringin 보충은 지방산 산화 증가에는 효과가 없었으나, 간 조직 지방산, 중성지방 및 콜레스테롤 합성 억제에는 매우 효과적인 것으로 나타났다. 또한 지질대사 관련 호르몬 및 adipokine 농도 비교결과, 혈장 인슐린 농도는 CD-naringin 및 naringin 보충에 의해 유의 적으로 감소되었으나, leptin, adiponectin, resistin, IL-$1{\beta}$, IL-6 등은 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한 췌장 lipase 억제제로서 비만 치료제로 이용되고 있는 orlistat에 비해 지질대사 개선 효과가 비슷하게 나타났으나, orlistat와는 다른 기전에 의한 지질대사 개선 효과로 보인다. 결론적으로, CD-naringin inclusion complex 및 naringin 단독 보충은 장기간의 고지방식이에 의한 지질대사 이상 및 인슐린 저항성 개선 효능을 기대해 볼 수 있으나, 혈장 leptin, resistin, IL-$1{\beta}$ 등의 염증성, 인슐린 저항성을 증가시키는 호르몬/adipokine 농도 감소 및 인슐린 저항성 개선 또는 항염증성 adipokine인 혈장 adiponectin 및 IL-6 농도 증가에 대한 효과는 나타나지 않는 것으로 판단되며, 두 물질의 효능 차이 또한 나타나지 않아 건강기능식품에 적용하기 위해서는 항산화 효과에 대한 CD-naringin의 유용성 연구가 필요할 것으로 판단된다.