Objective: p66Shc, a 66 kDa protein isoform encoded by the proto-oncogene SHC, is an essential intracellular redox homeostasis regulatory enzyme that is involved in the regulation of cellular oxidative stress, apoptosis induction and the occurrence of multiple age-related diseases. This study investigated the expression profile and functional characteristics of p66Shc during preimplantation embryo development in sheep. Methods: The expression pattern of p66Shc during preimplantation embryo development in sheep at the mRNA and protein levels were studied by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence staining. The effect of p66Shc knockdown on the developmental potential were evaluated by cleavage rate, morula rate and blastocyst rate. The effect of p66Shc deficiency on reactive oxygen species (ROS) production, DNA oxidative damage and the expression of antioxidant enzymes (e.g., catalase and manganese superoxide dismutase [MnSOD]) were also investigated by immunofluorescence staining. Results: Our results showed that p66Shc mRNA and protein were expressed in all stages of sheep early embryos and that p66Shc mRNA was significantly downregulated in the 4-to 8-cell stage (p<0.05) and significantly upregulated in the morula and blastocyst stages after embryonic genome activation (EGA) (p<0.05). Immunofluorescence staining showed that the p66Shc protein was mainly located in the peripheral region of the blastomere cytoplasm at different stages of preimplantation embryonic development. Notably, serine (Ser36)-phosphorylated p66Shc localized only in the cytoplasm during the 2- to 8-cell stage prior to EGA, while phosphorylated (Ser36) p66Shc localized not only in the cytoplasm but also predominantly in the nucleus after EGA. RNAi-mediated silencing of p66Shc via microinjection of p66Shc siRNA into sheep zygotes resulted in significant decreases in p66Shc mRNA and protein levels (p<0.05). Knockdown of p66Shc resulted in significant declines in the levels of intracellular ROS (p<0.05) and the DNA damage marker 8-hydroxy2'-deoxyguanosine (p<0.05), markedly increased MnSOD levels (p<0.05) and resulted in a tendency to develop to the morula stage. Conclusion: These results indicate that p66Shc is involved in the metabolic regulation of ROS production and DNA oxidative damage during sheep early embryonic development.
The anti-oxidant enzyme heme oxygenase-1 (HO-1) is known to exert anti-inflammatory effects. From a library of pyrazolo[3,4-d]pyrimidines, we identified a novel compound KKC080096 that upregulated HO-1 at the mRNA and protein levels in microglial BV-2 cells. KKC080096 exhibited anti-inflammatory effects via suppressing nitric oxide, interleukin1β (IL-1β), and iNOS production in lipopolysaccharide (LPS)-challenged cells. It inhibited the phosphorylation of IKK and MAP kinases (p38, JNK, ERK), which trigger inflammatory signaling, and whose activities are inhibited by HO-1. Further, KKC080096 upregulated anti-inflammatory marker (Arg1, YM1, CD206, IL-10, transforming growth factor-β [TGF-β]) expression. In 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinetreated mice, KKC080096 lowered microglial activation, protected the nigral dopaminergic neurons, and nigral damage-associated motor deficits. Next, we elucidated the mechanisms by which KKC080096 upregulated HO-1. KKC080096 induced the phosphorylation of AMPK and its known upstream kinases LKB1 and CaMKKbeta, and pharmacological inhibition of AMPK activity reduced the effects of KKC080096 on HO-1 expression and LPS-induced NO generation, suggesting that KKC080096-induced HO-1 upregulation involves LKB1/AMPK and CaMKKbeta/AMPK pathway activation. Further, KKC080096 caused an increase in cellular Nrf2 level, bound to Keap1 (Nrf2 inhibitor protein) with high affinity, and blocked Keap1-Nrf2 interaction. This Nrf2 activation resulted in concurrent induction of HO-1 and other Nrf2-targeted antioxidant enzymes in BV-2 and in dopaminergic CATH.a cells. These results indicate that KKC080096 is a potential therapeutic for oxidative stress-and inflammation-related neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease.
Hye In Ahn;Hyun-Jae Jang;Ok-Kyoung Kwon;Jung-Hee Kim;Jae-Hoon Oh;Seung-Ho Kim;Sei-Ryang Oh;Sang-Bae Han;Kyung-Seop Ahn;Ji-Won Park
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제33권4호
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pp.430-440
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2023
The type three secretion system (T3SS) is a major virulence system of Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). The effector protein Exotoxin S (ExoS) produced by P. aeruginosa is secreted into the host cells via the T3SS. For the purpose of an experiment on inhibitors with regard to ExoS secretion, we developed a sandwich-type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) system. Quercetin was selected because it has a prominent ExoS inhibition effect and also is known to have anti-inflammatory and antioxidant effects on mammalian cells. In this study, we investigated the effects of quercetin on the expression and secretion of ExoS using ELISA and Western blot analysis methods. The results showed that the secretion of ExoS was significantly decreased by 10 and 20 µM of quercetin. Also, popB, popD, pscF, and pcrV which are composed of the T3SS needle, are reduced by quercetin at the mRNA level. We also confirmed the inhibitory effect of quercetin on cytokines (IL-6, IL-1β, and IL-18) in P. aeruginosa-infected H292 cells by real-time polymerase chain reaction (PCR) and ELISA. Collectively, quercetin inhibits the secretion of ExoS by reducing both ExoS production and the expression of the needle protein of T3SS. Furthermore, these results suggest that quercetin has the potential to be used as an anti-toxic treatment for the inflammatory disease caused by P. aeruginosa infection.
본 연구는 대표적인 떫은 감 품종인 대봉감과 반시의 항산화, 항염증 및 면역증강 효과를 탐색, 비교하였다. 쥐 모델을 대상으로 4주간 대봉감과 반시의 섭취는 식이섭취량과 체중 변화에 영향을 미치지 않았다. B지역의 대봉감 섭취는 고지방식이 대조군 대비 유의적으로 카탈레이즈 활성 수준을 증가시켰으며, 간 조직의 지질과산화물인 말론디알데하이드 수준은 고지방식이 대조군 대비 A지역 대봉감을 섭취한 군에서 유의적으로 감소하였다. 또한 A지역 대봉감의 섭취는 염증인자인 IL-1 beta의 수준을 고지방식이군 대비 유의적으로 감소시켰다. 또 다른 대표적인 염증인자인 IL-6는 고지방식이 대조군과 비교하여 A지역과 B지역의 대봉감을 섭취한 군에서 유의적으로 감소시켰다. TNF-alpha 수준은 A지역의 대봉감을 섭취한 군에서 고지방식이대조군 대비 유의적으로 감소되었다. A지역 대봉감 섭취는 IgG의 수준을 고지방식이 대조군 대비 유의적으로 증가시켰다. IGF-1의 수준은 고지방식이 대조군과 비교하여 A, B, C 지역 대봉감 섭취군에서 증가하였다. 이상의 결과로부터 대봉감의 섭취는 우수한 항염증 효과와 면역증강 효과가 있을 것으로 사료된다.
Protoporphyrinogen oxidase(Protox) 저해형 제초제로 알려진 oxyfluorfen(OF), acifluorfen(AF), bifenox(BF) 및 oxadiazon(OD)에 대해 밀이 보리보다 특이적으로 내성을 보인 요인이 이들 제초제 처리로 인하여 발생된 singlet oxygen을 무독화할 수 있는 항산화효소 및 항산화제의 능력 차이와 Protox 저해에 의한 protoporphyrin Ⅸ(PPIX)의 축적량에 기인하는지를 알아 보고자 하였다. 내성을 보인 밀과 감수성을 보인 보리에 OF, AF, BF 및 OD을 $10^{-6}$ M로 침지처리후 광에 2, 4, 6 및 8시간 경과후에 항산화효소 활성 변화를 본 결과, 이들 네 가지 약제 처리 후 monodehy-droascorbate reductase(MDAR), catalase(CAL) 및 superoxide dismutase(SOD)의 활성은 밀보다 보리에서 활성의 감소폭이 컸다. POX 활성은 OF 처리후 단지 8시간에만 밀보다 보리에서 활성이 적었을 뿐, 그밖의 AF, BF 및 OD 처리에서는 차이가 없었다. GR활성은 4약제 처리후 시간이 경과될수록 활성이 증가하였으나, 밀과 보리간에 활성의 차이는 없었다. 네 가지 약제 처리 후 항산화제인 vitamin C 함량은 밀보다 보리에서 함량 감소가 컸었다. Vitamin E는 OF처리에서만 밀이 보리보다 함량 감소가 적었을 뿐 그 밖의 약제에 대해서는 차이가 없었다. 그리고 carotenoid 함량은 AF처리에서만 밀이 보리보다 함량 감소가 적었을 뿐 그 밖의 약제에 대해서는 차이가 없었다 Glutathione(GSH, GSSG) 함량은 네 가지 약제처리 모두 밀보다 보리에서 함량이 많았다. 이들 약제 처리후 PPIX 축적량은 밀보다 보리에서 많았고, 특히 OF및 AF 처리에서는 각각 밀보다 보리에서 2.3배 및 1.3배가 더 많이 축적되었다.
본 연구에서는 호염성 세균 Bacillus sp. Mk22를 사료에 섞어 투여함으로써 Penaeus monodon 새우의 성장증진과 Vibrio parahaemolyticus 와 흰반점바이러스(WSSV)의 감염 감소에 대한 영향을 조사하였다. 새우는 45일 동안 3가지 먹이를 공급하였 는데, 무첨가(대조구), 시판 프로바이오틱, 그리고 Bacillus sp. Mk22이었다. 호염성세균 Mk22를 투여한 새우들은 다른 그룹들의 새우들보다 성장(7.1 ± 0.21 g), 생존율(94.3 ± 0.58%), 체중증가(178 ± 4.93 g), 그리고 감소된 사료전환효율(0.8 ± 0.03 g)을 보였다. Bacillus sp. Mk22를 투여한 새우들은 다른 그룹의 새우들보다 새우배양 수조안에서 낮은 비브리오 수자(0.02 ± 0.01 × 102 CFU/ml)를 보였다. 이 세 그룹의 새우들을 비브리오나 WSSV로 공격감염을 하였다. 비브리오 감영에서는, 시판 프로바이오틱그룹과 Mk22 그룹에서 배양수조의 물 감염과 경구투여감염에서 치사 새우가 없었다. WSSV 감염에 대해서는, Mk22 그룹의 경우 새우배양 수조 감염에서는 68%의 생존율과 경구투여 감염에서는 20% 생존율이 45일째에 관찰되었고, 대조구와 시판 프로바이오틱 그룹에서는 모두 훨씬 빠른 시간 내에 100% 사망률을 보였다. 산화적 스트레스의 표지인, catalase와 superoxide dismutase와 같은 항산화 효소 활성은 비브리오와 WSSV 감염된 Mk22 그룹 모두에서 다른 그룹들에 비해 유의적으로 감소하였다. 이 사실은 Bacillus sp. Mk22는 산화적 스트레스 감소하는데 효과적이었고, 이는 감소된 감염효과로 인한 것으로 추정된다.
천연물로부터 미백활성 성분의 개발을 위하여 국내 자생식물 60종으로부터 추출물을 얻어, 이들의 멜라닌 생성과정의 주된 효소인 tyrosinase 활성 억제력을 평가하였다. 평가결과 노랑하늘타리(열매), 죽황, 누리장나무(잎), 우산고로쇠(잎) 추출물이 비교적 높은 tyrosinase 활성억제효과를 보였고, 이들의 $IC_{50}$ 값은 $50{\sim}100{\mu}g/mL$ 이었다. 이들의 멜라닌생성 억제효과를 B16F10 흑색종세포주를 이용하여 실험한 결과, 죽황추출물이 가장 높은 52%의 멜라닌생성 저해활성을 보였으며, 이는 기존 미백제인 arbutin (42%)에 비해 10% 높은 것이다. 죽황추출물로부터 용매추출 및 크로마토그래피 등의 분리과정을 거쳐 10가지 미백활성 성분을 분리하였다. 이들은 모두 페놀유도체 화합물로서, SM701과 SM702, SM703, BPR211은 hydroquinone계 화합물이며, SM707은 gallic acid계, SM704와 SM705, SM706, SM708, SM709는 ferulic acid계로 확인되었다. 이들의 유리기 소거효과를 hydorquinone과 비타민 C와 비교하여 측정하였을 때. $SC_{50}$ 값이 SM702와 SM709의 경우 $60{\sim}70{\mu}M$로 hydroquinone과 유사하였고, SM701과 SM708은 $30{\sim}40{\mu}M$로 비타민 C ($45{\mu}M$)보다 낮은 값을 보여 죽황추출물은 항산화활성이 높은 성분들을 함유하고 있음을 확인하였다. 이들 중 1,2-O-diferulylglycerol로 확인된 SM709 성분은 tyrosine hydroxylase 및 DOPA oxidase 활성을 각각 18, 60% 억제하였고, B16F10 흑색종세포주를 이용한 멜라닌생성량 억제시험에서 62%의 저해효과를 나타내 가장 높은 미백활성을 보였다. 따라서 죽황추출물의 미백활성은 주로 멜라닌 생성과정의 DOPA oxidsae 저해효과와 항산화효과에 의해 나타나는 것으로 생각된다.
정금나무 열매의 생리활성 및 항균활성을 측정한 결과, ABTS radical decolorlization은 $200{\mu}g/mL$에 $92.7{\pm}4.1%$로 positive control인 BHA의 $200{\mu}g/mL$에서 $52.4{\pm}1.9%$보다 높은 활성을 보였다. 지용성 물질의 항산화력을 나타내는 TBARS값은 $200{\mu}g/mL$에서 $74.4{\pm}2.9%$, antioxidant protection factor는 $200{\mu}g/mL$에서 $3.6{\pm}1.6%$로 항산화효과가 우수한 것으로 나타났다. 정금나무 열매 추출물의 angiotensin converting enzyme 활성억제 효과는 $200{\mu}g/mL$에서 $28.6{\pm}0.6%$의 저해율을 나타내었으며, xanthine oxidase 저해활성을 측정한 결과 $200{\mu}g/mL$에서 $43.3{\pm}0.8%$ 이상의 활성을 나타내었다. 정금나무 열매 추출물의 항균활성을 측정한 결과 Helicobacter pylori는 $200{\mu}g$/0.1 mL 농도에서 24 mm의 저해환을 보였고, Staphylococcus epidermidis는 28 mm의 저해환을, Staphylococcus aureus, Eschericia coil, Propionebacterium acnes는 각각 13 mm, 26 mm, 16 mm의 저해환을 나타내어 $200{\mu}g$/0.1 mL의 농도 이상에서는 모두 항균활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 주름억제 효과를 나타내는 elastase 억제효과를 측정한 결과 $200{\mu}g/mL$에서 $52.7{\pm}0.9%$로 비교적 높은 활성을 나타내었다.
본 연구는 시볼트전복, Haliotis sieboldii 치패를 이용하여 급격한 수온변화 스트레스에 따른 혈림프수의 변화와 간부위에서의 항산화효소 및 아가미 부위에서의 HSP70 mRNA의 변화를 조사하였다. 실험구는 $10,\;15,\;20^{\circ}C$(대조구), $25^{\circ}C$ 및 $30^{\circ}C$로 설정하였으며, 측정 시간은 0, 6, 12, 24및 48 h후에 측정하였다. 그 결과 실험기간 중의 생존율은 $30^{\circ}C$ 실험구를 제외한 모든실험구에서 100%의 생존율을 나타내었으며, $30^{\circ}C$ 실험구에서는 12 h이후 3마리가 폐사하여 90의 생존율을 기록하였고, 24 h째에는 전량 폐사하여 0%의 생존율을 나타내었다. 혈림프 수의 변화는 $15^{\circ}C$및 $25^{\circ}C$ 실험구의 경우 증가하는 경향을 나타내었고, $30^{\circ}C$ 실험구의 경우 감소하는 경향을 나타내었다. SOD의 경우 급격한 수온 스트레스 직후 모든 실험구에서 감소하는 경향을 나타내었으나, $30^{\circ}C$ 실험구에서는 계속 증가하는 경향을 나타내었고, 12 h 이후에는 모든 개체가 폐사하여 더 이상의 관찰은 할 수 없었다. 또한 10 및 $15^{\circ}C$ 실험구의 경우 24 h째에 모두 최고의 활성 상태를 나타내었으나, 48 h째에는 감소하는 경향을 나타내었고 $25^{\circ}C$ 실험구의 경우 대조군과 비교하여 감소하는 경향을 나타내었다. CAT에서는 수온 스트레스 직후 10 및 $25^{\circ}C$ 실험구에서는 대조군과 비교하여 낮은 활성을 나타내었으며, 시간의 지남에 따라 회복하는 경향을 나타내었다. 또한, $15^{\circ}C$ 실험구의 경우에는 6 h째에 가장 높은 CAT 활성을 나타내었으며, 이 후 차츰 회복하는 경향을 나타내었고, $30^{\circ}C$ 실험구의 경우에는 시간의 지남에 따라 유의적으로 활성이 낮아지는 경향을 나타내었다. HSP70 mRNA의 발현은 대조군($20^{\circ}C$)과 비교하여 $25^{\circ}C$ 48 h째 실험구를 제외한 모든 실험구에서 유의적으로 높게 발현되었다. 이상의 결과로, $20^{\circ}C$에서 순치된 시볼트전복은 급격한 수온 스트레스에 대해 많은 스트레스 요인으로 작용하는 것으로 나타났으며, 수온 스트레스에 대한 생리학적 방어 기작이 분자 레벨인 HSP70 mRNA에서는 신속히 발현되어 스트레스에 대처하지만, SOD나 CAT와 같은 항산화 효소의 발현은 다소 늦게 작용하는 것으로 나타났다. 그러나, 시간의 지남에 따라 $5^{\circ}C$ 내외의 스트레스와 저수온 스트레스의 경우에는 비교적 안정화되는 것으로 보여지며, $10^{\circ}C$ 이상의 고수온에 노출되었을 경우에는 생리학적 방어기작이 한계점에 이르러 더 이상 방어 기작이 작동하지 않아 폐사에 이르게 되는 것으로 나타났다.
국내 자생식물은 관상적가치 뿐만 아니라 환경 적응력도 뛰어나므로 정원 식물로 활용가능하다. 토양의 적절한 용적수분함량(volumetric water content, VWC)에 대한 연구가 이루어져 왔지만, 환경적 요인이 통제되는 온실 환경 조건에서 수행되는 경우가 많았다. 정원 식재를 고려할 때 빈번한 강우가 발생하는 실외 조건에서 자동 관수 시스템 연구가 진행될 필요가 있다. 본 연구는 노지 환경에서 너도개미자리, 벼룩이 울타리 및 산괴불주머니의 생장에 적합한 VWC를 조사하는 것을 목표로 하고 있다. 실험에 사용한 토양은 자연풍화 마사토를 이용했으며, FDR 방식의 토양 수분 센서 및 데이터로거를 사용하여 0.15, 0.20, 0.25, 0.30 ㎥·m-3 수준의 VWC를 유지시켰다. 벼룩이울타리는 VWC 처리간에 생장 및 항산화 효소 활성에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 단지 토양 수분 함량이 가장 높았던VWC 0.30 ㎥·m-3 처리에서 생존율이 낮았다. 물 사용 효율을 고려하면 벼룩이울타리는 VWC 0.15-0.20 ㎥·m-3 수준이 재배에 적합하다고 판단된다. 너도개미자리는 VWC 조건이 낮을수록 생장량이 높았다. 실외의 빈번한 강우로 인해 관수가 거의 이루어지지 않았던VWC 0.15 ㎥·m-3 처리에서도 식물 부피 및 생존율이 높았다. 산괴불주머니는 초장, 줄기 수, 측지 수, 생물중 및 건물중이 VWC 0.25 ㎥·m-3 처리에서 가장 높았다. 종합하면, 너도개미자리는 VWC가 낮은 환경에서도 관리가 가능한 식물종이며 벼룩이울타리와 산괴불주머니는 너도개미자리보다 VWC를 높게 유지하되 과도한 수분 공급은 피해야할 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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