알긴산은 미역이나 다시마 같은 갈조류의 세포벽에 존재하거나 또는 특정 박테리아들이 biofilm을 만들기 위하여 생산하는 L-${\alpha}$-guluronate 및 D-${\beta}$-mannuronate로 구성된 산성다당류이다. 전보에서 보고한 Sphingomonas sp. MJ-3의 외부 분해효소인 올리고알긴산 분해효소(oligoalginate lyase, MJ3-Oal)는 효소단백질의 N-terminal 영역에 내부 알긴산 분해효소인 polyM 분해효소의 단백질 서열과 상동성을 가지고 있었다. 본 실험에서는 MJ3-Oal이 외부 분해효소 활성뿐 만 아니라 내부 분해효소 활성도 함께 가지는 효소인지 알기 위하여 Saccharophagus degradans 2-40T 유래 올리고알긴산 분해효소인 Alg17c의 결정구조와 상동성 모델링을 행하였으며 기질과 수소결합을 할 것으로 예상되는 잔기 중 426번째 아미노산인 tyrosine을 구조가 비슷한 phenylalanine으로 돌연변이시키고 알긴산 분해양상을 wild type과 비교하였다. MJ3-Oal의 FPLC 결과를 보면 처음에는 이당류, 삼당류 등 올리고머가 증가하다가 최종적으로 단당류로 전환되었으나 Tyr426Phe 돌연변이 효소의 FPLC profile은 외부 분해활성만 나타내었다. 또한 $^1H$-NMR spectra 역시 MJ3-Oal은 polyM block 또는 polyMG block의 내부결합을 분해하는 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과들은 Sphingomonas sp. MJ-3 유래 올리고알긴산 분해효소는 외부 분해효소 활성 및 내부 분해효소 활성 모두 가질 가능성을 뒷받침해 준다.
대한민국 남해에서 채집한 해조류 감태(Ecklonia cava)로부터 분리한 Flavivirga eckloniae $ECD14^T$ 균주의 유전체서열을 분석하였다. 균주 $ECD14^T$의 유전체는 G + C 비율이 33.9%이며, 4,647개의 유전자와 4,595개의 단백질 코딩 유전자, 44개의 위유전자, 52개의 RNA 유전자를 포함한 단일 원형 염색체로 구성되었으며 그 크기는 2,371,912 bp였다. 파아지와 트랜스포존 유전자가 존재하며, CISPR array 관련 유전자 및 서열은 발견되지 않았다. 균주 $ECD14^T$는 해조 다당의 분해에 관여하는 alginate lyase와 ${\beta}$-glucosidase 유전자를 가지고 있었다.
알긴산의 응용을 위하여 인천지역에서 수집한 다양한 패류와 해수로부터 알긴산 분해효소 활성이 우수한 103개의 균주를 분리하고 그 중 M1-2-1, M6-1, C8-15 등 분해능이 가장 우수한 3균주를 선발하여 그 특성을 분석하였다. 이들은 모두 그람 음성 간균이었고, 운동성이 있는 호염성 세균이었다. 또한 생리 생화학적 특성 분석과 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석으로 M1-2-1과 M6-1은 Pseudoalteromonas 속, C8-15은 Vibrio 속에 속하는 세균으로 동정되었다. 이들의 알긴산 분해효소 활성은 알긴산이 유일한 탄소원인 APY 배지에 접종하여 $25^{\circ}C$에서 6-8시간 배양했을 때 최대로 나타났고, NaCl을 가했을 때 생장 및 효소 활성 모두 증진되었다. 이 분리 균주들의 알긴산 분해 조효소들은 $45^{\circ}C$와 pH 7.0-8.0에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, Pseudoalteromonas sp. M1-2-1과 M6-1 균주는 각각 2.7232 g/L와 1.976 g/L의 환원당 생성능을 보여, 산업적으로 활용 가능성이 높은 것으로 사료되었다.
6종류의 알긴산을 기질로하여 효소 반응을 시켜 알긴산 올리고당 제조를 시도한 결과, 실험에 사용한 효소의 경우 G-rich block에만 특이하게 작용하는 guluronate lyase 일종으로 G-block에 주로 작용하여 올리고당을 생성하는 것으로 확인되었다. 또한 4종류의 시판 알긴산중에서도 1종(Wako Co.)의 Na-alginate에 대해서 특이하게 6-7개의 올리고당 spot가 TLC에서 확인되었고, 그외 3종의 Na-alginate는 2-4개 정도의 올리고당 spot가 TLC에 나타났다. 6-7개의 spot가 확인된 Na-alginate(Wako Co.)를 기질로 대량 분해시킨 후 Sephadex G-25 및 Bio-gel p-2로 분획, 정제를 행하고 중합도를 측정하여 올리고당을 확인한 결과, 중합도가 각각 다른 4개의 올리고당을 확인할 수 있었다.
본 연구는 갈조류인 다시마, 모자반, 톳을 효소적 방법으로 가수분해하여 이를 이용한 바이오 에탄올 생산 가능성을 확인하고자 하였다. 가수분해 효소 분리 및 바이오 에탄올 생산 실험 결과는 다음과 같이 요약할 수 있다. 효소는 해수 및 채취한 갈조류 시료에서 분리하였으며, 갈조류의 주요 다당류인 alginate와 laminaran에 대한 효소 활성을 측정하였다. 또한 다시마, 모자반, 톳에 대한 직접적인 갈조류 가수분해 효과를 확인 하였다. 조효소에 의한 가수분해는 alginate에서 특히 높게 나타났으며, laminaran에서도 일부 활성을 보였다. 갈조류의 전처리에서 환원당의 생성은 외분비 효소와 전체 조효소에서 크게 차이가 없었으며, 기질로는 다시마에서 최대 1.90 g/L로 가장 높게 확인되었다. 모자반과 톳에서의 가수분해가 12 h 안에 완료되는 것에 비해 다시마는 72 h 동안 반응이 지속적으로 일어났다. 에탄올 발효는 환원당 생성량과는 무관하게 나타났는데 이는 전처리 방법에 따라 갈조류 다당류의 가수분해에 미치는 영향이 다르기 때문으로 생각되며, 또한 전처리 과정에서 생성되는 부산물이 영향을 미치기 때문인 것으로 생각된다. 갈조류 에탄올 발효에서 기질로 다시마를 이용했을 때 에탄올 생산 수율이 가장 높았다. 다시마를 이용한 발효에서는 발효균주 및 효소처리에 따른 에탄올 생산량이 대략 0.90 g/L로 유사하게 나왔다. 모자반에서의 에탄올 생산은 발효균주를 Saccharomyces cerevisiae로 하였을 때 최대 0.14 g/L로 확인 되었으며, 톳에서는 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 발효에서 에탄올생산이 전혀 확인되지 않았으며, Pachysolen tannophilus 에서만 0.09 g/L의 에탄올 생산이 생산되었다.
해조류의 발효가 가능하고 probiotic 특성이 우수한 유산균을 분리 선발한 후 이들의 미역과 다시마 발효능을 검토하였다. 미역 및 다시마 발효가 가능한 균주를 김치 젓갈, 된장으로부터 331 균주를 순수 분리하여 해조류 구성 다당(alginate, cellulose) 분해능, 균의 생육, 항균 활성 등을 비교 검토한 결과 4균주(stain No. 162, 164, 192, 196)가 우수하였다. 선발 균주 모두 인공위액, 인공담즙액, NaCl에 높은 생존율을 나타내었고 이들 4균주 중 No. 192가 가장 우수하였으며 Enterococcus faecium으로 동정되었다. 미역과 다시마를 이용하여 선발 유산균을 배양한 결과 No. 192 균주가 발효특성이 가장 양호하였으며, No. 162, 164, 196 균주도 양호하였다. 선발 유산균을 이용한 미역과 다시마에서 성장이 가능하였으며 발효 후 미역과 다시마 발효물의 항산화 활성이 증진되었다.
Microbulbifer agarilyticus GP101은 소라(Turbo cornutus)의 내장에서 분리되었으며 해조류 유래 다당류인 한천, 알긴산, ${\kappa}$-카라기난을 분해하는 특징이 있다. GP101 균주의 유전체는 4,255,625 bp 크기로 3,458개의 코딩 서열을 포함하며 55.4%의 GC 함량을 가진다. BLASTP 분석 결과 7개의 agarase, 5개의 alginate lyase, 10개의 glucanase, 4개의 chitinase, 2개의 xylanases, 1개의 ${\kappa}$-carrageenase, 1개의 laminarinase의 존재를 확인하였다. M. agarilyticus GP101의 유전체 정보는 다당류의 생물전환 공정에 이용할 수 있는 유전 정보를 제공할 수 있을 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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