간장의 숙성(熟成)에 관여하는 내염성 효모(酵母)인 Zygosaccharomyces rouxii의 Na-alginate에 의(依)한 포괄고정화(包括固定化)에 있어서 그 고정화조건(固定化條件)을 검토(檢討)하고, 간장국(麴) 가수분해액(加水分解液)을 조제(調製)하여 고정화(固定化) 효모(酵母) 의(依)한 발효(醱酵), 숙성(熟成)을 시도(試圖)하여 다음과 같은 결과(結果)를 얻었다. 1. Zygosaccharomyces rouxii 의 고정화(固定化) 조건(條件) 가. Na-alginate 용액(溶液)의 농도(濃度)가 2.0~2.5% 일때 bead의 형성(形成)이 가장 좋았으며, Na-alginate 용액(溶液)의 농도(濃度)가 고정화(固定化) 효모(酵母)의 발효력(醱酵力)에 미치는 영향(影響)은 인정(認定)되지 않았다. 나. 효모배양액(酵母培養液)과 Na-alginate 용액(溶液)의 혼합비율(混合比率)이 고정화(固定化) 효모(酵母)의 발효력(醱酵力)에 미치는 영향은 크게 인정(認定)되지는 않았으나 효모배양액(酵母培養液)의 비율(比率)이 높아짐에 따라 발효력(醱酵力)은 약간 증가(增加)하는 경향을 보였다. 다. 고정화(固定化) 효모(酵母)의 증식시간(增殖時間) 36 시간(時間) 이상(以上)일때 발효력(醱酵力)이 양호(良好)하였으며, 24 시간(時間) 이상(以上)일 때는 발효력(醱酵力)이 약간 떨어졌다. 라. 발효배지량(醱酵培地量)에 대(對)한 효모(酵母)의 고정화(固定化) gel 량(量)의 비율(比率)이 증가(增加)함에 따라 발효력(醱酵力)이 높아지는 경향을 보였다. 2. 고정화(固定化) 효모(酵母)에 의(依)한 간장국(麴) 가수분해액(加水分解液)의 발효시험(醱酵試驗) 간장국(麴) 가수분해액(加水分解液)을 고정화(固定化) 효모(酵母)에 의(依)하여 96 시간(時間) 발효(醱酵)시켰을 때 alcohol 발효(醱酵)는 거의 완료(完了)되었으며, 그때의 alcohol 농도(濃度)는 약2.6% (v/v) 이었다.
Zygosaccharomyces rouxii는 간장의 숙성 기간동안 중요한 역활을 하는 내염성 효모이다. 이 실험에서 사용된 Z. rouxii는 18% NaCl함유 YPD (1% yeast extract, 2% peptone과 2% glucose, pH5.0)에서 잘 성장하는 반면 Saccharomyces cerevisiae는 8% NaCl보다 적은 YPD에서만 자란다 15% NaCl존재하에서 Z. rouxii는 대수기에서 세포내에서 적합한 용질로서 많은 양의 글리세린을 축적하는데 이것은 내염성 효모의 특성이다. 세포막 지질 유동층의 화학 분석에 따르면 15% NaCl에서 자란 세포의 막구조는 더욱 단단하였고 그 유동층은 고농도의 식염의 배지에서는 세포내에 글리세린이 감소되었다.
염농도가 높은 전통식품인 된장에서 호염성 효모를 분리하였다. 2M NaCl에서도 생육할 수 있는 이 균은 Zygosaccharomyces rouxii로 등정되었으며 생리적 특성, rDNA를 probe로 이용한 RFLP 및 화합성 단핵 동종 효모 균주와 교배 결과에 의하여 이루어졌다. Z. rouxii YDJ 균은 생장속도가 S. cerevisiae 보다 느려 대수기를 완료하는데 $2{\sim}3$일 소요되었다. S. cerevisiae에서는 배지에 염농도가 높아질수록 glycerol보다 trehalose 함량이 크게 증가하였으나 Z. rouxii는 세포 내에 glucosamine, glycerol, trehalose함량이 증가하였다. 따라서 Z. rouxii의 호염성은 glycerol과 같은 polyol이외에도 trehalose과 glucosamine의 효과가 크게 나타났다. Trehalose 생합성 효소인 trehalose phosphate synthase는 S. cerevisiae보다 Z. rouxii에서 낮았으며 trehalose 분해효소인 trehalase도 S. cerevisiae 보다 Z. rouxii에서 낮았다. 그러나 Z. rouxii는 NaCl 처리시 trehalose가 증가하므로 내염성은 glycerol 이외에 trehalose에 의해서도 영향을 받는 것으로 생각된다.
간장의 속성 발효를 위한 방법으로 간장 발효에 간여하는 Z. rouxii BH-90과 C. versatilis BH-91 혼합 균체를 동시 고정화하여 이를 air bubble column reactor에 충진하여 국 고온 분해액을 주입하면서 연속적으로 발효를 시도하였다. 균체의 고정화 담체로는 실리카겔: 3% 알긴산소다 (1:1의 비율) 혼합액을 사용하여 Z. rouxii BH-90과 C. versatilis BH-91을 동시 고정화하여 air bubble column reactor에 충진하여 발효시킨 결과 발효 96시간 경과시 ethyl alcohol이 2.4% 생성되었으며 4-ethylguaiacol은 18mg/L가 생성되었다. Air bubble column reactor에서 Z. rouxii BH-90과 C. versatilis BH-91 혼합균체의 동시 고정화 beads의 연속적 속성 발효시 시작일로부터 30일까지는 ethyl alcohol이 2.5∼2.8%로 거의 일정하게 생성되었고, 40∼70일에는 약간 감소하였다. 그리고 동시 고정화 균체의 발효에서는 40일까지는 4-ethylguaiacol의 함량이 16∼18mg/L로 거의 일정하게 생성되었으나 발효 45일 이후 70일까지는 약간 감소하였다. 발효종료 후의 제품을 분석한 결과 동시 고정화 균체의 발효액에서는 2.4%의 ethyl alcohol이 생성되었고, 18mg/L의 4-ethylguaiacol이 생산되었다. 유리 아미노산의 함량은 glutamic acid, leucine, arginine, aspartic acid, Iysin 및 valine이 전체 아미노산의 50% 이상을 차지하고 있었다.
By using a synthetic medium simulated on the amino acid composition of soybeam, the effect of salt concentrations on the production of volatile organic acid by the strains of Zygosaccharomyces rouxii So-3101, a soy sauce yeast, was studied at the concentrations of 12.5, 18.0, 22.0 and 28.5% NaCl. The growth, consumption of glucose, and production of alcohol, total acid and volatile organic acid, showed the highest values at a concentration of 12.5% NaCl, and those values were decreased with an increase in the salt concentration. The ratio of volatile organic acid to total organic acid was remained at approximately the same level within the range of salt concentrations between 12.5~22.0%, whereas the ratio was decreased at a salt concentration of 28.5%. After incubation for 16 days, 8 volatile organic acids, i.e. acetic, propionic, n-butyric, isobutyric, isovaleric, isocaproic, n-caproic, and heptanoic acids, were detected by gas chromatography. Among the volatile organic acids, acetic acid was produced in the appreciable amiunt and its ratio to the other volatile acids was increased with an increase in the salt concentration.A small amount of isocaproic, propionic, isobutyric and isovaleric acids were produced, and n-caproic, n-butyric and heptanoic acids were detected only at the lower salt concentration.
개량식 고추장으로부터 동정한 효모들은 Candida glabrata C. guilliermondii. C. humicola. C. rugosa, C. zeylanoides, Cryptococcus uniguttulatus, Pichia farinosa, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae Zygosaccharomyces rouxii로 분류되었다. 재래식 고추장에서 동정한 효모는 C. glabrata, P. farinosa, S. cerevisiae, Z. rouxii로 분류되었으며 분포율이 높아 발효숙성에 깊이 관여할 것으로 생각되는 효모는 재래식과 개량식고추장에서 Candida, Pichia, Saccharomyces, Zygosaccharomyces등 4속이었다. 개량식 고추장의 발효숙성 중기와 후기에 나타난 Z. rouxii와 S. cerevisiae는 고추장용 메주에서 분리되어 그 기원이 되는 것으로 생각되며, 특히 Z. rouxii는 고추장용 메주에서 분포된 효모중 46%를 차지하였다. 발효숙성중 분포는 Z. rouxii가 15일 후에 33%, S. cerevisiae가 21일 후에 13%펄 각각 가장 높은 분포율을 보였다. Candida속의 경우 개량식 메주, 소맥코지, 콩코지 모두에서 분리되었으나 고추장의 발효숙성이 진행됨 에 따라 40%에서 10%로 점차 감소하는 경향을 보였다. 재래식 고추장에서는 발효음성 3개월 후에 Z. rouxii가 53%, 7개월 후에 S. cerevisiae가 26%로 가장 높은 분포율을 보였다. NaCl 과 glucose를 혼용한 배지에서 S. cerevisiae와 Z. rouxii 등 2종의 효모가 다른 효모에 비해 생육이 현저히 나타난 것은 이들이 고추장의 발효숙성 과정에서 분리된 빈도수가 높았다는 것과 무관하지 않을 것으로 사료된다. 특히 S. cerevisiae와 Z. rouxii 두 균주는 무염 또는 7% NaCl이 첨가된 배지에서 가장 먼저 가스를 생성하였으며 7% NaCl이 첨가된 조건하에서의 가스생산량은 Z. rouxii 및 S. cerevisiae 각각에서 0.024 ml/ml/hr, 0.013ml/ml/hr로 나타났다.
The aim of this study was to find out the rapid fermentation of soy sauce from koji hydrolyzate using column type reactor packed with immobilized yeast cells. Each immobilized cell of Zygosaccharomyces rouxii BH-90 and Candida versatilis BH-91 in the packed column type reactor produced 2.8% ethyl alcohol and 18mg/l 4-ethylguaiacol over 96 hours under the optimal condition. Continuous fermentation was performed by immobilized Z. rouxii BH-90 packed in column type reactor. Immobilized Z. rouxii BH-90 produced 2.30~2.85% ethyl alcohol during 30 days, and decreased gradually from 40 days to 80 days. Also C. versatilis BH-91 produced 4-ethylguaiacol at the constant rate of 16~18mg/l and decreased gradually after 40 days. Final product of soy sauce contained 2.8% ethyl alcohol and 18mg/l 4-ethylguaiacol. However, amino acid compositions of final products were consisted of predominantly glutamic acid, leucine, arginine, aspartic acid, lysine and valine, which were more than 50% of total amino acid.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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