• 한국가축번식학회지
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• 제27권1호
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• pp.15-23
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• 2003

본 연구는 VSV-G glycoprotein을 envelope으로 하는 pseudotyped retrovirus vector system을 이용하여 쥐의 유방상피세포인 HC11에서 human Lactadherin 유전자의 발현을 확인하고자 하였다. 실험에 사용한 vector는 개체내에서의 외래 유전자의 지속적인 발현에 의한 생리적인 부작용을 최소화하기 위한 구조로, 조직특이적이며 lactogenic hormone에 의해 유도적인 활성을 가지는 것으로 알려진 WAP promoter의 통제하에 도입하고자 하는 외래 유전자를 위치하도록 하였다. WAP promoter의 대조군으로 지속적인 활성을 나타내는 $\beta$-actin promoter를 사용하였으며, 이 각각의 promoter와 marker gene으로 E. coli LacZ gene을 재조합한 후 retrovirus vector system을 이용하여 HCll에 도입하였다. 세포의 genome 내로의 유전자의 전이는 PCR을 통해 확인하였고, RT-PCR의 수행으로 유전자의 발현을 확인하였다. Lactadherin 유전자를 이용한 실험도 동일한 과정으로 수행하였으며, RT-PCR의 결과에서 HCll 세포에서 Lactadherin 유전자의 발현이 insulin을 단독으로 처리한 군에 비해 insulin, hydrocortisone, prolactin을 동시에 처리한 군에서 우월하게 나타나는 것으로 확인되었다. 그러나 insulin 단독 처리군에서 유전자의 발현이 약하게 나타나는 것으로 관찰되어 WAP promoter의 leakiness에 대한 재고의 필요성이 요구되었다.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.94-94
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• 2002

Lactadherin (formerly known as BA46), a major glycoprotein of the human milk fat globule membrane, is abundant in human breast milk and breast carcinomas and may prevent symptomatic rotavirus infections. In this study, under the control of mouse whey acidic protein (WAP) promoter, the expression pattern of lactadherin (Ltd) in lactogenic hormone-dependent mouse mammary epithelial cell line HC11 were tested. pLNWLtd construct containing 2.4 kilobases of the WAP promoter and 1.5 kilobases of human lactadherin gene was stably transfered into HC11 cells using retroviral vector system. Integration and expression level of the transgene was estimated using PCR and RT-PCR, respectively. Prominent induction of Ltd gene under the WAS promoter was accomplished in the presence of insulin, hydrocortisone and prolactin, while induction with insulin alone resulted in lower expression. Our results demonstrate that the expression of the transgene is increased by synergistic effect of several lactogenic hormones, including insulin, hydrocortisone, and prolactin.

• Fisheries and Aquatic Sciences
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• 제17권4호
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• pp.471-478
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• 2014

Genomic organization, including the structural characteristics of 5'-flanking regions of two 65-kDa protein (WAP65) isoform genes associated with warm temperature acclimation, were characterized and their transcriptional responses to immune challenges were examined in the intestine, kidney and spleen of the mud loach (Misgurnus mizolepis; Cypriniformes). Both mud loach Wap65 isoform genes displayed a 10-exon structure that is common to most teleostean Wap65 genes. The two mud loach Wap65 isoforms were predicted to possess various stress- and immune-related transcription factor binding sites in their regulatory regions; however, the predicted motif profiles differed between the two isoforms, and the inflammation-related transcription factor binding motifs, such as NF-${\kappa}B$ and CREBP sites, were more highlighted in the Wap65-2 isoform than the Wap65-1 isoform. The results of qRT-PCR indicated that experimental immune challenges using Edwardsiella tarda, lipopolysaccharide or polyI:C induced the Wap65-2 isoform more than Wap65-1 isoform, although modulation patterns in response to these challenges were tissue- and stimulant-dependent. This study confirms that functional diversification between the two mud loach Wap65 isoforms (i.e., closer involvement of Wap65-2 in the acute phase of inflammation and innate immunity) occurs at the mRNA level in multiple tissues, and suggests that such differential modulation patterns between the two isoforms are related to the different transcription factor binding profiles in their regulatory regions.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제40권1호
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• pp.7-13
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• 2016

Effectiveness of transgene transfer into genome is crucially concerned in mass production of the bio-pharmaceuticals using genetically modified transgenic animals as a bioreactor. Recently, the mammary gland has been considered as a potential bioreactor for the mass production of the bio-pharmaceuticals, which appears to be capable of appropriate post-translational modifications of recombinant proteins. The mammary gland tissue specific vector system may be helpful in solving serious physiological disturbance problems which have been a major obstacle in successful production of transgenic animals. In this study, to minimize physiological disturbance caused by constitutive over-expression of the exogenous gene, we constructed new retrovirus vector system designed for mammary gland-specific expression of the hEPO gene. Using piggyBac vector system, we designed to express hEPO gene under the control of mammary gland tissue specific and lactogenic hormonal inducible goat ${\beta}$-casein or mouse Whey Acidic Protein (mWAP) promoter. Inducible expression of the hEPO gene was confirmed using RT-PCR and ELISA in the mouse mammary gland cells treated with lactogenic hormone. We expect the vector system may optimize production efficiency of transgenic animal and reduce the risk of global expression of transgene.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.14-14
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• 2001

본 연구는 생명공학 관련 기술개발에 의하여 신소재 물질을 생산하고 사람에게 안전하고 생리활성이 높은 고가의 의료용 단백질 생산기술을 체계화하며 형질전환 가축을 이용한 유용물질 생산에 따른 산업화와 부가가치의 극대화에 그 목적이 있다. 유즙으로 사람의 빈혈치료제인 EPO(Erythropoietin)를 분비할 수 있는 형질전환돼지를 생산하기 위하여 WAP(Whey Acidic Protein) Promoter(2.6kb) 하류에 사람의 조혈촉진유전자(EPO: 2.6kb)를 연결시켜 미세주입용 재조합 벡터(WAP-EPO : 약 7.8kb)를 구축하였다. 구축된 재조합 벡터를 1세포기 수정란에 약 2ng/ul 농도로 미세주입한 다음 외과적 방법으로 이식하였다. 이식 후 분만 모돈으로부터 생산된 자돈의 꼬리조직을 이용 게놈DNA를 추출하고 PCR 검정을 한 결과, 유즙으로 사람의 빈혈치료제를 생산할 수 있는 유전자가 도입된 형질전환돼지 $\boxDr$새롬이$\boxUl$ (♂)를 확인하였다. 또한 이렇게 꼬리조직으로부터 확인된 새롬이의 혈액과 정액을 채취, 게놈 DNA를 추출하여 외래 유전자 삽입여부를 PCR 방법으로 검정한 결과 꼬리조직과 마찬가지로 혈액 및 정액에서도 외래유전자가 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 이렇게 생산된 형질전환돼지 $\boxDr$새롬이$\boxUl$를 이용 계대번식을 통한 F$_1$ 산자의 생산과 유전자 전이율을 확인하기 위하여 $\boxDr$새롬이$\boxUl$정액을 이용한 인공수정을 실시하였다. 인공수정은 1999년 7월 1일부터 2000년 9월 8일 까지 총 78두의 모돈을 이용하였으며, 그 중 21두의 모돈이 분만하여 인공수정에 의한 분만율은 26.92%로 나타났다.(Table Omitted) Table 1에서와 같이 새롬이 정액을 이용한 인공수정에 의해 형질전환된 F$_1$ 자돈의 형질전환율은 17.98%로 나타났으며, 32두의 형질전환자돈 중 8두(암:4두, 수:4두)는 분만과 동시에 폐사하였거나 사육중 폐사하여 현재 24두(암:12두, 수:12두)가 생존하여 F$_1$ 간 교배계획에 의해 사육되고 있다. 이 중 암컷 4두는 현재 F$_2$ 자돈 생산과 함께 유즙내로 사람 빈혈치료제의 분비 유무를 검정중에 있으며, FISH 법에 의한 외래 유전자 삽입 검정을 확인 중에 있다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2002년도 춘계학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.88-88
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• 2002

Erythropoietin (EPO)는 조혈작용 (erythropoiesis)을 나타내는 호르몬으로서 사람의 빈혈치료제로 사용되며, 포유통물 중 사람, 생쥐 등의 유즙 내에 혈청 EPO 와 동일한 크기로 다량으로 존재한다고 보고된 바 있다. 생쥐의 WAP promoter를 이용하여 사람의 조혈촉진제인 EPO를 유즙으로 생산하는 형질전환돼지 (새롬이)의 유즙을 분석하기 위해 SDS-PAGE와 Western blotting 을 수행하였다. 먼저, 형질전환돼지의 유즙으로부터 원심분리에 의해 지방층을 제거한 후, 16.5% polyacrylamide gel 에서 PAGE를 수행하였다. (중략)

• 한국가축번식학회지
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• 제26권2호
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• pp.95-104
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• 2002

본 연구는 사람의 조혈촉진 유전자(hEPO)가 도입된 형질전환 돼지를 생산하기 위해 사계절동안 수행하였다. 약 8∼15개월령의 순종의 랜드레이스 경산돈 및 미경산돈 42두는 유전자 미세주입을 위한 1세포기 단계의 수정란 채란 및 이식을 위해 사용하였으며, 발정동기화 및 과배란 방법은 PG 600 주입 후 9일간 매일 20mg의 altrenogest를 사료에 첨가하여 급여하였다. Altrenogest를 9일간 급여 후 1,500IU의 PMSG와 500IU의 hCG를 주입하므로서 과배란을 유도하였다. 미세주입을 위한 유전자는 mouse whey acidic protein(mWAP) 프로모터에 hEPO 유전자를 연결하여 준비하였으며, 호르몬 처리후 23두의 공란돈으로 부터 650개의 난자를 회수하였으며, 이 중 83.1%(540/650)는 DNA 미세주입을 위해 전핵을 관찰할 수 있는 1-세포기의 수정란이었다. 이중 유전자가 미세주입 된 543개의 난자를 19두의 수란돈에 이식하였으며 7두의 임신돈으로부터 47두의 자돈을 생산하였다. 생산된 자돈 47두로부터 꼬리조직으로부터 분리된 DNA의 PCR 검정 결과 수컷 1두가 형질전환 양성반응을 나타내어 2.13%의 형질전환율을 나타내었으며, 이러한 연구의 결과는 생체반응기(bioreactor)연구에 있어서 형질전환 돼지생산의 성공적이며 유용한 정보를 제공할 것으로 사료된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.57-57
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• 2001

Erythropoietin(EPO)는 혈액의 구성성분 중에서 적혈구 세포 증식에 중요한 기능을 한다고 알려져 있으며, 최근에는 암, 에이즈의 치료 등에도 효과가 있는 것으로 확인되고 있다. 따라서 본 연구팀은 지금까지 hEPO 유전자를 이용하여, 형질전환 돼지 "새롬이"의 생산에 성공한바 있다. 새롬이의 정액을 활용하여 인공수정을 실시 새롬이의 Fl를 24두 생산하였다. 이에 대하여 "형질전환 돼지의 계대번식시 유전자 전이효율에 관한 연구"라는 제목으로 발표 할 예정이며, 형질전환에 사용된 promoter가 WAP이므로, Fl이 임신, 분만을 하여야만 유즙을 통하여 hEPO물질을 생산할 수 있다. 따라서, Fl(♂)$\times$Fl(♀)의 교배에 의하여 5두가 임신, 분만을 하였으며, 이들 중 1두는 분만 후 21일에 폐사하였으며, 나머지는 현재 정상적으로 사육되고 있다. 이들 5두에 대하여 분만 후 유즙을 채취하여 유즙속에 EPO의 발현여부를 검토하였다. EPO-ELISA kit(medac)를 사용하여 분석결과, 유즙을 8,000배로 희석을 하여야만 Standard curve(1.25~160 mIU/$m\ell$)안에서 EPO의 단백질 발현을 검출할 수 있었다. 5두의 각각 농도는 28, 58, 17, 37, 27 IU/${\mu}\ell$ 였다. 또한 cDNA EPO와 genome EPO를 CHO 동물세포에서 생산하여 10배로 농축한 결과 5.5와 11 IU/${\mu}\ell$의 농도로 유즙과 비교하면 약 20~30배의 낮은 발현양을 나타내었으며, 또한 이러한 결과는 소변에서의 결과(1.1 IU/$m\ell$)보다는 약 30,000배 이상 높은 발현량을 화인 할 수 있었다. 현재, 이들 유즙 물질을 활용 빈혈 질환실험동물을 이용하여 생리활성을 검정, 체내에서 metabolic clearance rate(MCR)를 검토 중에 있다. 또한 F2의 자돈생산은 모돈 5두에서 총 25두가 생산되었는데, 이중 20두 약 80%가 EPO 유전자의 전환율을 나타내었다. 이상을 종합하면, 1) 돼지이용 생리활성물질(EPO)을 유즙에서 대량으로 생산할 수 있는 system의 활용가능성을 국내에서 처음으로 확인하였으며, 2) EPO에 있어서는 국제적으로도 형질전환 가축생산은 최초로 성공하였으며, 현재로서는 생산되어진 물질의 정제수준에 따라 활용가치가 결정되어 질 것으로 사료된다. 생리활성 물질을 생산할 수 있는 형질전환 돼지 생산의 성공은, 앞으로 형질전환 가축생산 뿐 만 아니라, 장기이식 및 복제돼지 생산의 활용 면에서의 응용가능성이 기대된다.