• 한국미생물·생명공학회지
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• 제20권4호
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• pp.384-389
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• 1992

식물근부균 Fusarium solani의 생육을 강력히 길항하는 Bacillus sp. YBL-7을 토양으로부터 분리하였으며 그 길항기작이 항생물질임을 이미 보고하였다. 분리된 생물방제균 Bacillus sp. YBL-7 균주들 siderophore, 가수분해능 등의 타 방제기능을 도입할 수 있는 다기능적인 방제균으로 육종하기 위해 plasmid vector pE194를 이용하여 효율적인 형질전환 system을 확립하고자 하였으며, 이때 필요한 여러가지 조건을 조사하였다. 생물방제균 Bacillus sp. YBL-7 원형질체 형성의 최적조건은 5시간 배양된 균체를 사용함으로써, 최종농도가 200${\mu}g$/ml인 lysozyme을 $37^{\circ}C$에서 90분간 처리함으로써 원형질체 생성율이 가장 높았다. 삼투압안정 완충제인 SMM bufferso의 sucrose 농도는 0.5M에서 안정하였고, mannitol 재생 배지에서 원형질체를 재생시켰을 경우 첨가된 agar의 농도가 1.2%에서, mannitol은 0.7M의 농도에서 가장 재생율이 높았다. 형질전환율은 polyethylene glycol 농도가 40%(w/v)일 때 가장 높았으며, plasmid DNA와의 접촉시간과 발현배양시간은 각각 10분, 120분에서 가장 효과가 좋았다. 또한 plasmid DNA의 농도는 5$\mu$g/ml 첨가에서 가장 높았으며, 형질전환된 숙주균주 Bacillus sp. YBL-7내에서의 pE194는 매우 안정하게 유지되었으며, 외붕 전자가 도입된 전환체와 숙주균주가 동일한 억제력을 갖는 것으로 확인되었으며, agarose gel 상에서도 고유의 plasmid pE194의 band를 확인 할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제17권2호통권82호
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• pp.241-247
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• 2007

Paenibacillus macerans 유래의 cycloinulooligosaccharide fructanotransferase (CFTase) 유전자(cft, 2832 bp, 103.8 kDa)를 효모 표층발현 vector인 pCTcon (GAL1 promoter)에 subcloning 하였다. 구축된 pCTECFTN (9.0 kb)를 숙주세포인 s. cerevisiae EBY100에 형질전환한 후, uracil이 결핍된 배지와 inulin 함유배지에서 선별하였다. cft 유전자는 GAL1 promoter에 의해 효모 형질전환체에서 성공적으로 발현되었다. inulin으로부터 cyclofructans (CFs)로 생산하는 효소적 능력으로부터 표층발현 유무를 확인하였다. YPDG배지에서 48시간 배양 후 분획한 균체는 5.52 unit/ l 의 활성을 보였다. CF 생산을 위한 효소의 최적 반응 조건으로 pH 8.0, 반응온도 $50^{\circ}C$, 기질농도 5%, 기질은 Jerusalem artichoke 등의 inulin과 표층 발현 CFTase 효소반응 결과, cycloinulohexaose (CF6), cycloinuloheptaose (CF7), 그리고 cycloinulooctaose (CF8)이 생성되었고, 이 중에서 CF6가 주 생성물이었다.

• 한국동물학회지
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• 제38권3호
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• pp.340-347
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• 1995

D. melanogaster를 대상으로 두 종류의 P element construct, 즉 Pc[(ry+)B]와 p[(ry+)$\Delta$SX9]을 사용한 형질전환 실험을 통하여 자율적 및 비자율적인 P element construct간의 vector로써의 효율성을 분석했다. 자율적인 P element 내에 rosy 유전자를 포함하고 있는 Pc[(ry+)B] construct를 진정 M 계통형인 ry506 돌연변이 계통에 주입시켰다. 또한 비자율적인 P element 내에 rosy 유전자를 포함하고 있는 p[(ry+)$\Delta$SX9] construct와 전이효소의 공급원으로써 p-$\Delta$2-3hs$\pi$ helper plasmid를 역시 같은 계통의 ry506 돌연변이 계통에 주입시켰다. Dechorination 방법에 의해 총 1143 embryo를 대상으로 microinjection 한 결과, 모두 35 계통의 형질전환된 정상형의 눈을 가진 계통을 얻었다. P element construct를 주입시킨 전체 1143 embryo 중에서 약 20% 정도가 성체로 부화되었으며, 부화된 개체 가운데 약 40% 정도가 눈 색깔이 거의 정상형과 같은 G0 transformant 로 나타났다. 그러나 생식력을 가진 G0 transformant의 약 40% 만이 G1 transformant로 나타남으로써 모두 35 계통의 transformant를 얻었다. 따라서 G0 단계에서 나타난 형질전환 현상에는 반드시 rosy transformant의 염색체 삽입에 의해서 만이 아니라 세포질내에서도 construct내의 rosy 유전자의 발현이 가능한 것으로 분석되었다. 또한 형질전환율에 있어서는 Pc[(ry+)B]와p[(ry+)$\Delta$SX9] construct 간에 유의한 차가 없는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때, 실험 목적에 따라 자율적인 P element 또는 helper DNA를 이용한 비자율적인 P element를 효과적인 vector 로 선택 이용함으로써 특정 유전자를 곤충집단내로 침투 및 고정시킬 수 있다고 판단된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권3호
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• pp.390-399
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• 2012

Endoglucanase gene egIV was cloned from Trichoderma viride AS 3.3711, an important cellulose-producing fungus, by using an RT-PCR protocol. The egIV cDNA is 1,297 bp in length and contains a 1,035 bp open reading frame encoding a 344 amino acid protein with an estimated molecular mass of 35.5 kDa and isoelectronic point (pI) of 5.29. The expression of gene egIV in T. viride AS 3.3711 could be induced by sucrose, corn straw, carboxymethylcellulose (CMC), or microcrystalline cellulose, but especially by CMC. The transcripts of egIV were regulated under these substrates, but the expression level of the egIV gene could be inhibited by glucose and fructose. Three recombinant vectors, pYES2-xegIV, $pYES2M{\alpha}$-egIV, and $pYES2M{\alpha}$-xegIV, were constructed to express the egIV gene in Saccharomyces cerevisiae H158. The CMCase activity of yeast transformants $IpYES2M{\alpha}$-xegIV was higher than that of transformant IpYES2-xegIV or $IpYES2M{\alpha}$-egIV, with the highest activity of 0.13 U/ml at induction for 48 h, illustrating that the modified egIV gene could enhance CMCase activity and that $MF{\alpha}$ signal peptide from S. cerevisiae could regulate exogenous gene expression more effectively in S. cerevisiae. The recombinant EGIV enzyme was stable at pH 3.5 to 7.5 and temperature of $35^{\circ}C$ to $65^{\circ}C$. The optimal reaction condition for EGIV enzyme activity was at the temperature of $55^{\circ}C$, pH of 5.0, 0.75 mM $Ba^{2+}$, and using CMC as substrate. Under these conditions, the highest activity of EGIV enzyme in transformant $IpYES2M{\alpha}$-xegIV was 0.18 U/ml. These properties would provide technical parameters for utilizing cellulose in industrial bioethanol production.

• 식물조직배양학회지
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• 제24권5호
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• pp.305-311
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• 1997

Bacillus thuringiensis는 그람 양성 토양 세균으로 포자형성시 결정화된 내포체를 형성하는데, 이 내포체를 구성하는 결정단백질은 각 곤충에 대하여 특이적인 독성을 나타낸다. 살충성 결정단백질 중 Cry II A 결정단백질은 인시류와 쌍시류 곤충에 모두 특이적으로 작용한다. 결정단백질은 살충제로서 불안정하고 포장에서 지속성이 낮은 단점을 가지고 있으므로, 본 연구에서는 Cry II A 결정단백질 유전자가 형질전환된 담배 식물을 제작하고자 하였다. cry IIA 유전자가 삽입된 벡터를 대장균에 형질전환한 후, 알칼리 용액에 대한 용해도의 차이를 이용하여 Cry II A 결정단백질(70 kDa)을 분리하였고, 분리한 Cry II A 결정단백질을 trypsin 처리하여 활성화된 Cry II A (50 kDa)를 확인하였다. 식물 형질전환을 위하여 두 개의 CaMV 35S promoters에 의해 발현이 조절되는 식물 발현 벡터에 cry II A 유전자를 클로닝 하였다. 이 식물 발현 벡터를 Agrobacterium을 이용한 엽편형질 전환을 통해 담배(N. tabacum var. Petit Havana SRI)에 형질전환 시켰으며, 재분화 과정을 거쳐 여섯 개체의 형질전환 식물체를 얻었다. Southern blot을 통하여 분석한 결과 세 개체 내에 cry II A 유전자가 존재하였는데, 한 개체에는 하나의 cry II A 유전자가, 또 한 개체에는 두 개의 cry II A 유전자가, 다른 한 개체에는 잘려진 형태의 cry II A 유전자가 존재함을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 얻어진 cry II A 형질전환 식물체는 살충성 검정 등을 거친 후 내충성 식물 생산 및 후대 유전 양상 분석을 위한 기초 자료로 이용될 수 있을 것이다.

• 미생물학회지
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• 제41권4호
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• pp.239-245
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• 2005

Transformation-associated recombination (TAR) 클로닝 법은 복잡한 게놈으로부터 염색체 내의 특정부위나 유전자를 선택적으로 분리할 수 있다. 이 방법은 목적 유전자에 근접한 작은 게놈DNA 염기서열 정보를 필요로 한다. 이 기술은 효모의 spheroplast transformation을 시키는 동안 목적으로 하는 유전자의 5' 또는 3' 서열을 포함하고 있는 TAR vector와 게놈DNA사이에서 일어나는 상동성재조합에 의해 이루어진다. 본 연구에서는 plasmid 모델시스템을 이용하여 target hooks 내에 존재하는 비상동성 염기서 열이 상동성재조합에 미치는 영향을 조사하였다. plasmid에 존재하는HIS3유전자와 변형시킨 his3-TRP1-his3 단편 사이의 상동성재조합의 효율은 $Ura^+$ 형질전환체의 형질분석에 의해 이루어졌다. $Ura^+$ 형질전환체의 수는 7종류의 서로 달리 변형된 his3-TRP1-his3 단편들을 사용하였을 매 거의 동일하게 나타났다. 그러나 $Trp^+His^+$ positive recombinants의 빈도는 변형된 his3-TRP1-his3 단편 내에 비상동성 영역에 부정확한 간격을 지닐 때 현저한 감소를 나타내었다. 이러한 결과로서, 부정확한 간격이 target hook과 substrate DNA 사이에 일어나는 상동성재조합을 방해하는 것으로 사료된다. 그러므로 이종간의 상동유전자를 클로닝 할 때에는 target hook내의 비상동성 염기서열이 존재한다면 이것이 정확한 간격을 지니는지 여부를 중요란 요인으로 고려해야 한다.

• 미생물학회지
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• 제36권3호
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• pp.203-208
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• 2000

재조합 플라스미드 pAL850에 함유된 Bacillus circulans KCTC3004 $\alpha$-amylase 유 전자를 pUB110을 이용하여 shuttle 플라스미드 pALS111을 만들어 Bacillus 세포에 이동. 발현시켰다. Bacillus subtilis(고초균)와 Bacillus megaterium(거대균)으로 형질전환된 pALS111로부터 $\alpha$-amylase는 세포증식과 비례하여 생산되었다. 형질전화주가 생산하는 $\alpha$ -amylase의 최대활성을 유전자 공여 균주인 B. circulans와 비교했을 때 고초균은 약 95배, 거대균은 약 34배 정도의 높은 활성을 나타내었다. 그리고 대장균 형질전환주는 분비율이 10% 정도인데 반하여 고초균 형질전화주는 생산된 효소전부를 , 거대균 형질전환주는 약 98%를 세포외로 분비함을 보임으로써 고초균과 거대균은 실용적인 면에서 대장균보다 우월 함을 나타내었다, pALS111의 각 숙주 내에서의 안정성을 살펴본 결과 거대균에서는 92%, 고초균에서는 76%, 대장균에서는 38% 로 나타났다. SDS-PAGE와 zymogram을 통해 추정 된 대장균과 고초균, 거대균에서 발현된 효소의 분자량은 약 55,000으로 확인되었다. 이들 형질전환주가 생산하는 $\alpha$-amylase는 starch 에 작용하여 주된산물로서 maltotriose 이상의 다양한 maltooligosaccharide들을 생산함이 확인 되었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권3호
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• pp.207-217
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• 1998

한국에서 자생한 자연산 tumor 조직과 근권토양으로부터 형질전환율이 높은 hypervirulent Agrobacterium spp를 분리하기 위해서 Salix, Diospyros, Populus 및 Malus에서 형성된 tumor 조직과 근권토양을 채취하괴 Schroth 선택배지와 New and Kerr 배지를 이용하여 78 균주의 colony를 특성에 따라 분리하였다. 이중에서 48 균주가 당근 disc에서 tumor를 형성하였으며 tumor를 형성한 균주중 형성시기가 빠르며 크기가 커 hypervirulent 균주로 생각되는 A. tumefaciens SP101을 biotype 1, 그리고 A. tumefaciens SM042를 biotype 2로 동정하였다. 토양중에서 선발한 A. tumefaciens SM042와 disarmed A. tumefaciens PC2760에 kanamycin 저항성 유전자를 함유하고 있는 binary vector pGA643을 도입하여 conjugant인 A. tumefaciens SM643과 A. tumefaciens PC643을 kanamycin과 tetracycline이 함유된 최소배지에서 획득하였다. 연초의 형질전환을 위해서 conjugant Agrobacterium과 연초조직을 동시배양 후 2,4-D와 kanamycin이 함유된 선발배지에 치상하여 형질전환을 유도한 결과 A. tumefaciens SM643이 A. tumefaciens PC643보다 더 많은 캘러스가 형성되었다. 그러나 A. tumefaciens PC643을 사용한 형질전환 캘러스는 대부분 friable한 캘러스로 유도되었으며 정상적으로 식물체로 생장하였으나 A. tumefaciens SM643을 사용한 캘러스는 매우 딱딱하며 둥그런 형태의 캘러스와 friable한 캘러스가 혼재한 상태로 생장하였으며, 이중에서 friable한 캘러스는 정상적인 shoot가 형성되었으나 딱딱한 캘러스로 유도된 형질전환체는 식물체로 형성되지 않고 반구형 미색의 전형적인 tumor 캘러스로 생장하였다. 한편 형질전환시 캘러스를 유도하지 않고 직접 shoot를 형성시킨 결과 disarmed Ti-plasmid를 사용하지 않고 wild-type Ti-plasmid를 사용해도 정상적인 형질전환체를 획득할 수 있었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제37권4호
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• pp.511-516
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• 2010

아그로박테리움 매개에 의한 형질전환 기술을 이용하여 국내에서 육성된 품종 'Sweet Yellow'로부터 유도된 체세포배 (배발생캘러스 포함)로 intron-GUS유전자가 전이된 식물체를 획득하기까지의 과정이 제시되었다. Intron-GUS 유전자를 포함하고 있는 Agrobacterium tumefaciens AgL1(O.D=0.7~1.6)에 30분 감염시켜 3일간 공동배양 한 후 $4^{\circ}C$에서 7일간의 저온처리를 거친 후 cefotaxim $250\;mg{\cdot}L^{-1}$ 첨가 체세포배발아 배지에 배양된 체세포배 (배발생캘러스 포함)들 대부분으로 유전자가 전이된 것을 GUS transient assay에 의해 확인하였다. Intron-GUS유전자가 전이된 체세포배 (배발생캘러스 포함)로부터 신초원기를 유도한 후 신초를 재분화시켰고, 재분화된 신초로부터 다신초가 형성되도록 하였다. 다신초로부터 신초의 일부를 떼어 GUS transient assay 분석을 실시하여 intron-GUS 유전자의 발현을 확인한 후 발근시켜 순화 후 온실로 옮겼다. GUS transient assay에 의해 확인된 유전자 발현율은 100%였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제41권4호
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• pp.216-222
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• 2014

본 연구는 팔레놉시스의 원괴체유사체를 재료로 효율적인 형질전환 체계를 확립하기 위해 수행되었다. 이를 위해 PPT 제초제에 저항성을 가지는 bar 선발유전자와 노화지연 형질을 보이는 ORE 7 유전자를 함유하는 pCAMBIA 3301:ORE7 벡터를 이용하여 유전자총 형질전환 시 발사횟수 증가 그리고 유전자총 실험 전후에 삼투압조절제 처리를 하여 실험목적을 달성하고자 하였다. 실험결과, 2회 발사처리가 1회나 3회 발사횟수와 비교하여 1.5 ~ 2.5배 이상의 형질전환 효율을 보여 주었으나, 신초 재분화율이 낮고 갈변율은 높은 현상을 보여 주었다. 다양한 삼투압 조절제 처리에 의한 형질전환효율 향상 실험에선 0.2 M mannitol과 0.2 M sorbitol 이 2가지 조절제 혼합처리가 단용처리나 무처리구에 비해 형질전환 효율과 신초재 분화율에서 최소 1.5 ~ 3배 이상의 효율을 보여 주었고, 갈변율도 2배 이상 낮게 나타났다. PCR 분석을 통하여 bar 유전자와 ORE7 유전자가 도입되었음을 확인하였고, 임의로 선발한 형질전환 팔레놉시스 21개체를 대상으로 real-time PCR 분석을 통해 4개체가 1 copy의 목적유전자를 가지고 있으며, 나머지 17 개체들은 2 copy 이상의 유전자를 보유하고 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서 생산된 형질전환 팔레놉시스 개체들은 순화과정을 거쳐 화분으로 이식하여 생육과정을 거쳐 꽃이나 잎에 변이가 없는 개화과정을 보여 주었다.