• Journal of Periodontal and Implant Science
• /
• 제37권4호
• /
• pp.859-869
• /
• 2007

Naked DNA and standard vectors have been previously used for gene delivery. Among these, PEI can efficiently condense DNA and has high intrinsic endosomal activities. The aim of this study is to investigate whether the cationic polycation PEI could increase the transfection efficiency of BMP expressing DNA using a vector-loaded collagen sponge model. BMP-2/pcDNA3.1 plasmid was constructed by subcloning human BMP-2 cDNA into the pcDNA3.1 plasmid vector. PEI/DNA complexes were prepared by mixing PEI and BMP-2/pcDNA3.1 and the constructed complexes were loaded into the collagen sponges. In vitro studies, BMSCs were transfected with the PEI/BMP-2/pcDNA3.1 complexes from collgen sponge. The level of secreted BMP-2 and alkaline phosphatase activities of transfected BMSCs were significantly higher in PEI/BMP-2/pcDNA3.1 group than in BMP-2/pcDNA3.1 group (p<0.05). Transfected BMSCs were cultured and mineralization was observed only in cells treated with PEI/BMP-2/pcDNA3.1 complexes. In vivo studies, PEI/BMP-2/pcDNA3.1/collagen, BMP-2/pcDNA3.1/collagen and blank collagen were grafted in skeletal muscle of nude mice. Ectopic bone formation was shown in PEI/BMP-2/pcDNA3.1/collagen grafted mouse 4 weeks postimplantation, while not in BMP-2/pcDNA3.1 grafted tissue. This study suggests that PEI-condensed DNA encoding for BMP-2 is capable of inducing bone formation in ectopic site and might increase the transfection rate of BMP-2/pcDNA3.1. As a non-viral vector, PEI offers the potential in gene therapy for bone engineering.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제40권5호
• /
• pp.380-387
• /
• 1997

Pectate lyase isoenzymes을 분비하는 Erwinia carotovorn subsp. carotovora LY34는 식물조직을 연화시키는 연부균이다. 이 균주로부터 게놈 DNA를 분리하여 Sau3Al 제한효소로 부분 절단한 다음 pBluescript $SK^+$ 벡터에 클로닝하여 pectate Iyase를 분비하는 클론을 분리하였다 분리 결과 4.2 kb크기의 DNA 단편을 가지고 있었으며 이를 다시 재클로닝하여 3.1 kb크기의 pelCI유전자를 함유하는 pLYPA100을 구하였다. 이 유전자의 DNA 염기서열을 분석한 결과 374 개의 아미노산을 구성하는 1,122 bp의 ORF를 확인하였다. 시작코돈과 종결코돈은 ATG와 TAA였으며 초기 서열 22개의 아미노산으로 구성된 전형적인 원핵세포의 signal peptide가 존재하였다. PeICI의 단백질 염기서열을 다른 단백질과 유사성을 분석한 결과 Erwinia carotovera subsp. carotovora Er 균주의 PelIII, Erwinia carotevora subsp. carotovora SCR193 균주의 PeIC 및 Erwinia caretovora subsp. atroseptica C18 균주의 Pel3과 유사하였으며 PLbc family에 속하였다. PeICI의 분자량은 40,507, pI는 7.60으로 계산되었다.

• 미생물학회지
• /
• 제41권4호
• /
• pp.275-280
• /
• 2005

Bacillus anthracis는 탄저병의 병원체이다. 탄저병의 독소는 Bacillus anthracis가 가진 세가지 독소로 이루어져 있다. protective antigen (PA), lethal factor (LF)그리고 edema factor (EF)로 구성되어 있다. PA는 세포수용체와 결합하여 활성화 과정을 거친 후 LF 흑은 EF를 세포질 안으로 이동시켜 주는 역할을 한다. LF는 금속이온 $(Zn^{2+})$ 의존적 단백질 가수분해 효소로써 탄저병에 감염된 동물들의 치사독소로 작용하게 된다. 따라서 LF에 대한 특성 분석 및 억제재 개발에 관한 연구는 탄저치료제 개발에 매우 중요한 과정이라 할 수 있다. 본 연구에서는 탄저독소의 치료제 개발을 위해 선행되어야 하는 LF 고처리량 활성검증방법 및 저해제 선별에 더 높은 효율을 가지기 위해 이러한 시스템 방법 등을 이용하여 세포내 검정방법의 기초 자료를 마련하고자 하였다. 이를 위하여 yeast를 숙주로 한 LF 발현 vector의 구축과, 구축한 발현 시스템을 yeast에 형질전환 하여 plasmid의 안정성 및 LF유전자의 발현을 확인하였다. 본 연구는 LF유전자의 발현을 진핵세포 내에서 처음으로 시도했으며, 세포내 검증 시스템 도입의 기초적 자료를 제공하였다. Yeast내에서의 LF의 발현은 탄저병의 저해제 선별이나 활성측정검증을 생체 내에서 용이하게 할 수 있다는 가능성을 나타냈다.

• 한국육종학회지
• /
• 제43권5호
• /
• pp.448-456
• /
• 2011

적색 과육 '홍양' 품종에서 차등발현하는 유전자를 찾기 위하여 mirror orientation selection (MOS)과 결합된 suppression subtractive hybridization (SSH) 실험을 수행하였다. 그 결과, 288개의 cDNA clone을 확보하였으며, colony PCR을 통해 192개의 positive clone을 선발하였고, 이들을 sequencing하였다. NCBI/Genbank 데이터베이스의 BLAST 검색를 이용하여 염기서열을 분석한 결과, 30개의 clone에서 기존에 알려진 유전자기능과의 유사성을 확인할 수 있었으며, 10개의 clone이 특이유전자였다. 그 중 3개의 clone(AcF21, AcF42, AcF106)은 과실 후숙과 관련된 ACC-oxidase와 상동성이 있었다. SSH의 결과를 통해 얻어진 이 유전자들의 차등발현양상을 확인하기 위하여 reverse transcription PCR(RT-PCR)과 quantitative real-time PCR(qReal-time PCR) 분석을 실시하였다. qReal-time PCR분석과 RT-PCR분석에서 모두 동일한 결과를 확인할 수 있었으며, 3개 clone 모두 '홍양'에서의 유전자발현수준이 '헤이워드'보다 더 높았다. AcF21은 다른 유전자들보다 가장 높은 발현수준을 나타내었는데, 만개 후 120일과 160일 모두 '홍양'에서의 발현수준이 높았다.

• 생명과학회지
• /
• 제30권12호
• /
• pp.1070-1077
• /
• 2020

암세포에 항암제를 처리하게 되면, 세포증식, 이동성 또는 약물 내성과 관련된 많은 유전자들의 발현 변화가 발생하며, 유전자 발현 변화는 상호간의 조절 네트워크에 의해 밀접하게 연결될 수도 있다고 추측된다. 본 연구에서 p53 유전자 유무가 다른 A549와 H1299 인간 폐암세포에 독소루비신을 처리하면, 원종양유전자인 FosB의 발현은 증가하지만, 원종양유전자인 SETDB1의 발현은 감소하지만, 단백질 발현의 양적인 차이가 발생한다는 사실을 알 수 있었다. TF motif binding 분석 프로그램을 이용하여 SETDB1과 FosB 프로모터지역에서의 p53단백질의 결합가능성을 분석한 결과, SETDB1의 경우 18부위, FosB의 경우 21 부위의 p53 결합부위를 예측할 수 있었다. SETDB1과 FosB 프로모터의 subcloning하여 luciferase 분석을 수행한 결과, p53은 SETDB1과 FosB을 음성적으로 조절한다는 사실을 알 수 있었다. 또한, H1299 세포에 p53의 과발현은 SETDB1 과 FosB의 발현을 감소시킬 수 있음을 RT-PCR, western blot, qPCR, 면역염색 실험을 통해 확인하였다. 이러한 결과를 종합하여 본다면, p53에 의한 SETDB1과 FosB 유전자 발현 조절은 항암제 처리과정에서 나타나는 암세포의 사멸과 생존에 대한 기능적 조절 네트워크로 사료된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제44권4호
• /
• pp.796-805
• /
• 1997

연구배경 : 세포주기의 활성화, 그 중에서도 특히 $G_1$/S 이행에 관여하는 세포주기관련 단백질들은 암발생에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. $G_1$ 세포주기 관련 단백질 중의 하나인 cdk4 (cyclin dependent kinase 4)의 억제제로 알려져 있는 p16 유전자는 최근에 밝혀진 종양억제유전자중의 하나로서 MTS1 (multiple tumor suppressor 1)이라고도 불린다. p16 유전자는 지금까지 알려진 어느 종양관련 유전자보다도 유전자변이의 빈도가 높은 암억제유전자인데, 특히 비소세포폐암인 경우는 70% 이상의 세포주에서 p16 단백질의 발현이 없는 것으로 밝혀져 있어 p16 유전자는 비소세포폐암 발생에 매우 중요한 역할을 할 것이라고 알려져 있다. 본 연구에서는 비소세포폐암에서 p16을 이용한 유전자치료의 타당성을 입증하기 위하여 다음과 같은 연구를 시행하였다. 방 법 : p16이 결여된 비소세포폐암 세포주 (NCI-H441)에, 정상섬유아세포에서 총 RNA를 추출하여 역전사효소 및 DNA 중합효소반응으로 증폭된 p16 cDNA를 유핵세포 발현 vector인 pRC-CMV plasmid에 subcloning하여 구축된 pRC-CMV-p16 plasmid vector를 lipofectin을 이용하여 유전자 이입한 후, 단백질을 추출하여 Western blot 분석과 면역침전법으로 $G_1$ 세포주기관련 단백질의 변동을 관찰하고, colony 형성능을 비교함으로써 암억제효과를 확인하였다. 결 과 : p16이 유전자주입된 NCI-H441 세포주에서 p16과 cdk4가 복합체를 형성하고 있고 인산화 Rb가 대조 세포주에 비해 감소되어 있음을 확인할 수 있어, p16이 cdk4와 결합함으로써 cdk4에 의한 Rb의 인산화를 방해하고 이에 따른 $G_1$ 세포주기 정체에 의해 종양억제효과가 나타난다는 설명을 뒷받침할 수 있었다. Clonogenic assay 결과는 p16 유전자주입된 NCI-H441 세포주의 colony 형성능이 대조 세포주에 비하여 현격히 감소함을 관찰하였다. 결 론 : 이상의 결과로 p16(MTS1) 유전자를 p16 단백질을 발현하지 못하는 비소세포폐암 세포주에 주입할 경우, 주입한 유전자에서 생성되는 p16 단백질이 cdk와 결합하여 Rb 단백질의 인산화를 저하시켜 궁극적으로 암억제 효과를 일으킬 수 있음이 확인되었고, 이는 향후 비소세포폐암의 유전자치료에 있어서 p16 유전자의 이용 가능성을 확인한 기초자료가 된다고 생각된다.

• 한국어병학회지
• /
• 제6권2호
• /
• pp.93-101
• /
• 1993

효모의 RNAI유전자는 RNA processing에 관여 하는지 혹은 RNA transport에 관여 하는지 아직까지 유전자의 기능이 정확히 알려져 있지 않은 실정이다. 효모의 RNAI 유전자의 기능을 파악하기 위한 방법으로 본 연구에서는 rna1-1 mutant gene을 cloning하여 이에 대한 DNA sequence를 조사함으로써 RNAI 유전자와 rna1-1 유전자의 차이점을 이해하고자 하였다. rna1-1 marker를 갖는 yeast strain(R49)로 부터 genomic DNA를 추출하여 이를 BglII로 절단하여 genomic southern blotting을 행한 결과 wild type의 경우와 동일하게 3.4 kb에서 hybridization되는 signal을 얻었으며, RNAl 및 rna1-1이 yeast genome내에 single site로 존재함을 보여 주는 결과를 얻었다. mutant strain으로 부터 얻은 3.4 kb의 BglI fragment를 pUC19의 BamHI site에 subcloning하여 transformant들을 얻었고, wild type RNAl 유전자를 probe로 하여 rna1-1 mutant 유전자를 cloning할 수 있었다. pUC19에 cloning된 RNA1유전자 및 rna1-1유전자로부터 다양한 Ba131유도체를 얻어 이들에 대한 염기 서열을 비교한 결과 transcription initation site에서부터 down stream쪽으로 17 아미노산위치에 TCC가 TTC로 대치되어 있었으며 그 결과 serine이 phenylalanine으로 변환되는 결과를 얻었다. Wild type RNAI gene의 5'-region에는 3군데의 TATA-like sequence가 true TATA box인지 확인하기 위하여 Bal3I deletion에 의해 -103nt까지 deletion된 유도체를 얻었으며 ${\Delta}RNAI$, rna1-1, 81-2-6 clone이 rna1-1 allele와 complementation한지 확인하였으나 ${\Delta}RNAI$은 TS-complementation을 하지 못하였다. 따라서 현재까지 TATA-box라고 알려진 부분은 promoter로 작용하지 못함을 확인하였다.

• 미생물학회지
• /
• 제41권2호
• /
• pp.99-104
• /
• 2005

유전자 lacZYA가 aces 유전자의 프로모터 하단에 연계된 $(P_{aceB}-lacZYA)$ 리포터 플라스미드를 함유하는 Escherichia coli를 이용하여 glyoxylate bypass를 매개하는 유전자중하나인 aceB의 발현을 조절하는 것으로 여겨지는 Corynebacterium glutamicum클론들을 색판독에 의해 분리하였다. 이 중 한 개의 클론을 선택하여 분석할 결과 이 클론을 함유한 E. coli는 리포터 플라스미드에서 발현되는 $\beta-galactosidase$의 활성 이 약 $40\%$ 감소하였고 이는 클론에서 발현되는 단백질이 aceB프로로터에 작용함에 기인한 것으로 판단되었다. 서열분석결과 ORF1과 ORF2의 두 개의 인접한 ORF가 발견되었고 이중 ORF2가 reporter plasmid의 $\beta-galactosidase$의 활성 감소에 직접적으로 기여함을 알 수 있었다. ORF1은 206아미노산으로 구성된 23,218 Dalton의 단백질을 발현하는 것으로 여겨졌고, 유사성 분석결과 ECF-type에 해당되는 RNA polymerase의 sigma factor를 암호화하는 것으로 보여 sigH로 명명하였다. 유전자 sigH의 기능을 밝히기 위해 gene disruption technique을 이용하여 sigH 유전자가 기능을 하지 못하는 돌연변이 균을 제작하였으며 이 균주는 야생형에 비해 성장속도가 저하됨을 관찰하였다. 또한 변이균은 oxidative stress를유발하는 pumbagin둥에 대해서도 민감성을 나타내었다. 이들 결과는, 유사성 분석결과에서도 볼 수 있듯이 sigH유전자가 세포성장과정 중 처하게 되는 각종 stress중 특히 oxidative stress에 대한 대응과 관련되어 발현될 수 있음을 암시한다.상관관계는 공간적인 범위가 10$\times$10km 이하인 경우에 높게 나타났다. 하지만 공간범위가 그 이상이 될 경우에는 그 내부에서 나타나는 다양성으로 인해 통계적인 상관성이 현격하게 낮아지는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 지역 및 국가 단위의 환경변화모델에서 모델의 공간적인 구성범위가 일정한 수준을 넘으면, 그 내부에서 발생하고 있는 다양성이 급격하게 증가하여 지표피복변화의 원인과 결과를 정확하게 파악하기 힘들게 된다는 것을 의미한다. 10$\times$10km의 공간적인 범위는 농업생산이 위주가 되는 사바나 지역에서는 주로 개별 마을이 차지하고 있는 공간적인 범위와 대체적으로 일치한다. 따라서 사바나 지역에서 나타나는 지표피복변화의 다양성을 고려하면서 보다 정확하게 모형화하기 위해서는 마을단위에서 나타나는 지표피복변화과정이 최소의 모델단위가 되어야 함을 시사한다. 아니라 다른 방법으로 영향을 미치고 있다는 것을 알 수 있었다., 계절별로는 여름철에 강수가 집중됨으로서 습성강하물 침착량이 총량적으로 증가하였으며, 그 값은 $SO_4^{2-}\;2.118g/m^2/season,\;NO_3^-\;1.509g/m^2/season,\;Cl^-\;2.185g/m^2/season,\;NH_4\;^+\;1.096g/m^2/season$로. 나타났다. 계절별 잎의 평균 pH의 변화는 봄 pH $5.9\pm0.5$, 여름 pH $5.5\pm0.4$, 가을 pH $5.1\pm0.3$을 나타내었고, 엽중 수용성 황함량의 계절별 평균값은 봄 $0.012\pm0.004\%$, 여름 $0.012\pm0.002\%$, 가을 $0.020\pm0.007\%$ 수준을 보이고 있다. 수피 내 함유되어

• 생명과학회지
• /
• 제14권4호
• /
• pp.650-656
• /
• 2004

야생벼의 일종인 Oryza grandiglumis (CCDD, 2n=48)는 도열병, 잎집무늬마름병, 흰빛잎마름병, 그리고 벼멸구와 같은 병충해에 저항성을 가지는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 곰팡이와 해충에 반응하여 차별 발현하는 유전자를 클로닝 하기 위하여 상처처리와 yeast extract를 Oryza grandiglumis에 0시간과 24시간 각각 처리하였다. 유전자의 클로닝을 위하여 희귀 발현유전자의 클로닝에 효율적인 것으로 알려진 Suppression Subtractive Hybridization (SSH) 방법이 처리 후 24시간 된 식물을 재료로 사용되었다. 그 결과, 776개의 cDNA clones이 확보되었으며, 유전자 발현의 진위여부를 빠르게 스크린하기 위하여 colony array가 수행되었다. 115개의 colony가 positive로 판명되었고, 이들의 평균 insert size는 400 bp에서 700 bp에 이르렀고, 이들에 대한 염기서열 분석이 수행되었다. 염기서열 분석 결과, 68개 clone들이 알려진 기능의 유전자와 homology를 나타냈으며, 이중에서 16개 clone이 일차대사에 관련된 것과 유사성을, 5개가 plant retrotransposon과 유사성을, 5개가 식물 방어기작 관련 metallothionein-like gene과 염기서열 유사성을 보였다. 이외에 다양한 유전자들이 아미노산 합성관련, membrane transport, signal transduction등에 관여하는 유전자들과 상동성을 나타내었다. 이들 유전자중에서 4 개의 클론(ogwfi-161, ogwfi-646, ogwfi-663, ogwfi-695)들이 선발되었고 이들에 대한 Northern 분석이 수행되었다. Northern 분석 결과 ogwfi-161, ogwfi-646, ogwfi-663, ogwfi-695는 wounding과 yeast extract처리 에 의한 차별 발현이 확인되었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, SSH방법은 병충해등과 같은 조건에 의해 차별 발현되는 유전자들을 빠른 시간 내에 다량으로 발굴할 수 있는 매우 효율적인 방법이라고 생각된다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제26권2호
• /
• pp.122-129
• /
• 1998

최근 생물방제균으로 주목받고 있는 Enterobacter cloacae의 방제기작이 이 균에 의해 토양내에서 생산된 휘발성 ammonia이며 ammonia의 생산에는urease가 관계한다는 보고를 근거로 하여, 항생물질 생산성 균주로 선발된 우수한 길항균주에 암모니아 생성능, 즉 urease 유전자를 유전적으로 부가함으로써 항진균성 길항물질 생산과 암모니아 생산이 동시에 이루어 질 수 있는 새로운 다기능의 생물방제균을 유전적으로 육종하고자 하였다. 저병해 인삼경작지로부터 식물근부균 Fusarium solani의 생육을 강하게 억제하는 길항세균 한 균주 SH14균주를 분리, 선발하였으며, 분리된 균주를 동정한 결과 Bacillus subtilis이거나 그 근연종으로 추정되었다. 억제기작 실험을 통해 길항균주 B. subtilis SH14에 의해 생산되는 항진균성 길항물질은 외막가수분해효소와 같은 고분자 물질이 아니라 열에 안정한 저분자의 항생물질임을 알 수 있었다. 한편 ammonia 생산을 위한 urease의 유전자는 urease 생산력이 강력한 호알칼리성 Bacillus pasteurii의 urease 생산유전자를 E. coli-Bacillus shuttle vector인 pEB203에 subcloning하였고, 이어서 pGU 366으로 명명된 이 recombinant plasmid를 선발된 항진균성 길항균주 B. subtilis SH14에 PEG-induced protoplast transformation 방법으로 도입, 발현시켰으며, 최적조건을 조사하여 90분간의 lysozyme 처리과정 후 1.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 DNA와 40% PEG4000의 첨가로 약 6.5$\times$$10^{-4}$의 형질전환율을 얻을 수 있었다. 아울러 암모니아 생성능이 부가된 생물방제균 B. subtilis SH14(pGU366)에 의해 식물근부균 F. solani에 대한 생육억제력이 증가되는지 여부를 억제거리 측정법과 균체중량법을 통해 확인한 결과 urease 유전자가 도입된 형질전환체 B. subtilis SH14(pGU366)의 근부균 생육억제능이 각각 36.7%, 44.0%정도로 숙주균주인 B. subtilis SH14에 비해 근부균 생육억제능을 보다 강하게 나타내었음을 알 수 있었다. 따라서 항진균성 항생물질 생산성 생물방제균 B. subtilis SH14에 외부의 urease유전자를 도입하여 ammonia 생성능을 부가함으로써 생물방제력의 상승효과를 거둘 수 있었다.