• 한국식품과학회지
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• 제42권4호
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• pp.424-430
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• 2010

본 연구는 기존의 불가사리 콜라겐 유래 펩타이드, 저분자화된 펩타이드, 저분자화 된 펩타이드의 젤라틴 나노입자의 비교를 통해 면역 활성의 증진을 확인하였다. 불가사리 펩타이드는 Sephadex G-75 gel 크로마토그래피 분리를 통해 5-7 kDa 범위의 분자량 범위의 시료를 얻었고, MALDI-TOF MS 분석에 의해 펩타이드의 정확한 분자량을 측정하였다. 0.1% collagenase를 처리한 펩타이드의 분자량은 기존의 불가사리 콜라겐 유래 펩타이드에 비해 약 2,000 m/z까지 분자량이 감소되는 효과를 보였다. 이는 2개의 폴리펩티드결합으로 상호 결합되어 감겨있던 콜라겐형구조가 collagenase의 작용으로 풀어진 후 효소의 영향을 받아 가수분해되었기 때문인 것으로 사료된다. 이후 $20^{\circ}C$에서 젤라틴으로 시료를 나노입자화 하여 TEM 및 DLS로 분포와 크기를 각각 확인하였다. 이후 인간섬유아세포에 대한 세포독성 측정 결과, 나노입자화 한 ALPG가 최고 농도인 1.0 mg/mL의 농도에서 11.64%로 가장 낮게 나타났다. 각 시료의 면역물질의 분비 정도를 확인하기 위해 macrophage에서의 $NO^-$ 분비를 측정하였는데 역시 나노 입자화 한 ALPG가 $40\;{\mu}M$로 가장 높은 $NO^-$ 생성량을 보였다. 또한 불가사리 나노 시료가 저분자 추출물과 비교해 B cell 생육도를 10% 이상 향상시켰다. UV 자극에 의해 형성되는 염증물질로 잘 알려진 prostaglandin의 생성을 정량하기 위해 $PGE_2$ 방법을 이용하였는데, 나노입자를 가해준 모든 군에서 농도 의존적으로 $PGE_2$의 생성이 감소하였고 역시 ALPG가 860 pg/mL로 $PGE_2$를 가장 적은 농도로 생성하였다. 마지막으로 confocal 현미경을 이용해 인간 면역 세포에 나노입자가 얼마나 효과적으로 침투하는지를 관찰하였는데 나노 시료의 경우 입자의 크기가 50-200 nm로 분산됨에 따라 일반 불가사리 펩타이드에 비해 세포 침투의 용이성이 크게 증진되는 것을 확인하였다.

• 한국수산과학회지
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• 제19권6호
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• pp.547-557
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• 1986

전보(Pyeun and Kim, 1986)에서와 같이 고등어 유문수조직에서 정제한 3종의 알칼리성단백질분해효소에 대하여 활성최적조건, 열안정성. 기질친화도, 화학약제에 대한 영향 및 분자량 등을 규명하였다. 각 정제효소의 반응최적조건을 기질별로 검토한 결과, casein에 대하여 Enz. A는 pH 9.4, Enz. B와 Enz. C는 pH 9.8이었으며, Hb에 대하여 Enz. A는 pH 9.2, Enz. B는 pH 10.2, 그리고 Enz. C는 pH 9.8이었고, 최적반응온도는 공히 $45^{\circ}C$였다. 효소농도 $2{\mu}g/ml,\;2\%$ casein 기질의 반응조건에서 반응시간(x)에 대한 활성도 (y)의 관계를 분석한 결과, Enz. A는 60분. Enz. B는 40분, 그리고 Enz. C는 50분까지 1차 반응의 관계가 성립하였으며, 이때의 반응속도식은 Enz. A는 y=3.6x, Enz. B는 Y=6.0x, 그리고 Enz. C는 y=4.2x였다. 열안정성을 검토하기 위하여 $50^{\circ}C$에서 5분간 가열했을때, Enz, A는 $90\%$, Enz. B는 $33\%$, 그리고 Enz. C는 $37\%$가 각각 불활성화하였다. Lineweaver-Burk의 도식에 의한 효소의 기질친화도를 측정한 결과, casein기질에 대하여 Enz. A는 Km이 $5.0{\times}10^{-3}\%$, Enz. B는 Km이 $1.0{\times}10^{-3}\%$, 그리고 Enz. C는 Km이 $3.6{\times}10^{-3}\%$였다. 금속 ion에 의한 영향을 검토한 결과, $Ag^+,\;Hg^{2+}$는 효소활성을 저하시켰으나, $Mn^{2+},\;Sn^{2+}$ 및 $Pb^{2+}$ 이온은 활성을 증가시켰다. Enz. B와 Enz. C는 soybean trypsin inhibitor에 의해 상당히 저해되었다. 따라서 효소 B와 C는 serine 계 단백질분해효소로 판단되었다. SDS-PAG 전기영동과 Sephadex G-100 겔 여과법에 의하여 각 정제효소의 분자량을 측정한 결과, Enz. A는 $27,500{\pm}2.500$, Enz. B는 $20,500{\pm}1,500$, 그리고 Enz. C는 $15,250{\pm}250$이었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제29권3호
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• pp.293-310
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• 1991

우리 나라의 중요한 인체 기생충인 간흡충(Cloncrchis sinensis)을 연구함에 있어, 단세포를 항체제조법을 이용하여 보았다. 간흡충의 성충 조(조)항원으로 면역한 마우스의 비장 림프구와 형질세포종(plasmacytoma) 세포를 융합하여 간흡충의 항원에 대한 단세포를 항체를 분비하는 융합 세포를 만들어, 간흡충 항원에 대한 특이 단세포군 항체를 얻은 후, 이의 특성 및 반응하는 항원의 특성을 분석하고, 아울러 ELISA 억제 검사법을 이용하여 면역 진단법 상 특이도의 개선을 모색하였다 그 결과, 간흡충 항원에 대한 항체를 분비하는 총 29개의 융합세포군을 확인하였는데, 이 중 8개는 다른 기생 충 항원에 대해 교차 반응을 나타내지 않는 높은 특이성을 지니고 있었다. 클로닝 후 선택된 6종류의 단세포군 항체는 Ig Gl이 넷이었고, 나머지는 Is G2b 및 Is A로 나타났다. 위와 같이 선택된 단세포를 항체 중 4개만이 자연 감염 시에도 표현되는 항원 결정기에 대하여 생성된 것으로 판단되었다. 효소 면역 전기영동 블로팅으로 분자량 l0KD, 34 KD 항원은 각각 CsHyb 0714-20 및 CsHyb 0605-10단세포군 항체와 항원항체 반응을 나타냄을 확인하였다. 간접형광항체법을 이용하여 카 항원 결정기의 충체 내 위치를 관찰한 결과, CsHyb 0714-20 단세포를 항체에 대한 항원은 충체의 표면 및 실질 대부분에 분포하였으며, CsHyb 0605-10 및 CsHyb 0714-25 단세포군 항체에 대한 항원은 충체의 실질 및 장관의 상피세포에 분포하고 있었다. 한편 CsHyb 0605-23 단세포군 항체에 대한 항원은 주로 자궁내 충란 주위에 많이 분포하고 있었다. 단세포군 항체와 반응하는 Sephadex G200 겔 여과 항원 분획을 검색한 결과, 검색한 항원 결정기는 모두 전반적으로 빨리 젤 여과를 통하여 나온 분회에 속하여 있는 것을 알 수 있었다. 한편 이 단세포군 항체를 인체 간흡충증의 진단에 응용하여 그 특이도를 개선하고자 하였다. 통상적인 방법의 ELISA로 시행한 항체가로는 간흡충 감염자의 75U가 양성 병위에 들었으며, 정상 대조군의 7.l%, 폐흡충 감염 자의 37.5%가 위 양성 반응을 보였다. 반면 CsHyb 0605-23 단세포군 항체를 함께 사용하여 ELISA억제 검사를 시행한 결과는 간흡충 감염자의 77.1%가 양성으로 판정되었으며, 정상 대조군 및 폐흡충 감염자에서는 양성 반 응을 찾아 볼 수 없어서 100%의 특이도를 나타내었다. 따라서 이러한 단세포군 항체를 이용한 ELISA 억제검사 는 통상적인 ELISA 검사에 비하여 같은 정도의 민감도를 유지하면서도 매우 높은 특이도를 가지는 것으로 판단되었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.494-500
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• 1996

중요한 환경문제로 대두되고 있는 중금속 오염의 대처 방안으로 식물을 이용한 경제적인 정화 방법을 모색하고자 미나리의 중금속 흡수능력을 검정하고 카드늄 결합단백질을 동정하였다. 미나리의 중금속 흡수능력은 미나리를 카드늄 $(Cd^{2+})$, 크롬 $(Cr^{3+})$ 및 납 $(Pb^{2+})$의 농도를 달리한 배양액에서 재배한 후 미나리에 잔류하는 중금속을 정량함으로써 측정되었다. 중금속의 처리 기간은 3일과 7일로 하였고, 생장 저해가 일어나는 농도까지 처리하였다. 카드늄은 16.68 ppm, 크롬은 20 ppm까지 지속적으로 잔류량이 증가하였고 그 농도 이상에서는 생장 저해가 일어나면서 잔류량의 증가율이 둔화되었다. 식물체 부위별 카드늄과 크롬의 잔류량은 뿌리에서 월등하게 높게 나타났고 줄기와 잎의 순으로 낮아졌다. 납의 경우는 카드늄과 크롬에 비하여 잔류량이 가장 높은 뿌리에서 4배 정도 잔류량이 높게 나타났다. 20 ppm의 중금속 용액에서 7일간 재배한 미나리 뿌리에는 건조중량 1 g에 대하여, 카드늄이 6.1 mg, 크롬은 5.2 mg 그리고 납은 23.6 mg이 잔류하고 있었다. 이것은 잔류하고 있는 중금속 중에서 카드늄은 80%, 크롬은 92%그리고 납은 96%이상이 미나리 뿌리에 잔류하고 있는 것이다. 20 ppm카드늄이 함유된 배양액에서 7일간 자란 미나리 뿌리 추출액을 Sephadex G-50과 DEAE-Cellulose 크로마토그래피를 수행하여, polyacrylamide gel 전기영동 상으로 단일 단백질 분리대의 중금속 결합단백질을 정제하였다. 이 단백질의 분자량은 gel filtration 상에서 약 5,000 Da이었고 아미노산의 조성을 보면 산성 아미노산이 27.3%, cystein이 9.9%로서 중금속 결합단백질의 특성을 가지고 있었다. 그러나 그 아미노산 조성은 지금까지 알려진 phytochelatin과는 다른 새로운 중금속 결합단백질로 나타났다.

• 대한미생물학회지
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• 제21권1호
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• pp.151-161
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• 1986

In order to develop sensitive and sepcific assay methods for E. coli heat labile enterotoxin(LT) hybridoma cell lines secreting LT specific monoclonal antibody were obtained. LT was purified from cell lysate of E. coli O15H11. The steps included disruption of bacteria by French pressure, DEAE Sephacel ion exchange chromatography, Sephadex G200 gel filtration, and second DEAE Sephacel ion exchange chromatography, successively. Spleen cells from Balb/c mice immunized with the purified LT and $HGPRT^{(-)}$ plasmacytomas, $P3{\times}63Ag8.V653$ were mixed and fused by 50% (w/v) PEG. Hybrid cells were grown in 308 wells out of 360 wells, and 13 wells out of them secreted antibodies reacting to LT. Among these hybridoma cell 1G8-1D1 cell line was selected since it had produced high-titered monoclonal antibody continuously. By using culture supernatant and ascites from 1G8-1D1 cells the monoclonal antibody was characterized, and an assay system for detecting enterotoxigenic E. coli was established by double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The following results were obtained. 1. Antibody titers of culture supernatant and ascites from 1G8-1D1 hybridoma cells were 512, and 102, 400, respectively by GM1-ELISA and its immunoglobulin class was IgM. 2. The maximum absorption ratio of 1G8-1D1 cell culture supernatant to LT was 90% at $300\;{\mu}g/ml$ of LT concentration. LT concentration shown at 50% absorption ratio was $103.45{\mu}g$ and the absorption ratio was decreased with tile reduction of LT concentration. This result suggests that monoclonal antibody from 1G8-1D1 hybridoma cell bound with LT specifically. 3. The reactivities of 1G8-1D1 cell culture supernatant to LT and V. cholerae enterotoxin(CT) were 0.886 and 0.142(O.D. at 492nm) measured by the GM1-ELISA, indicating 1G8-1D1 monoclonal antibody reacted specifically with LT but not with CT. 4. The addition of 0.1ml of ascites to 0.6mg and 0.12mg of LT decreased the vascular permeability factor to 41% and 44% respectively, but it did not completely neutralize LT. 5. By double sandwich ELISA using monoclonal antibody, as little as 75ng of the purified LT per ml could be detected. 6. The results by assay of detecting LT in culture supernatants of 14 wild strains E. coli isolated from diarrhea patients by the double sandwich ELISA were almost the same level as those by reverse passive latex agglutination.

• 한국식품과학회지
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• 제23권5호
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• pp.554-560
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• 1991

한국에서 재배되고 있는 긴마, 단마 및 참마에서 분리한 전분의 특성을 조사한 결과는 다음과 같다. 전분의 평균 입자크기는 각각 단마 $23.5{\mu}m$, 긴마 $23.9{\mu}m$ 및 참마 $18.2{\mu}m$로 나타났고 표면 형태는 품종에 관계없이 불규칙한 난형을 나타내었으며 입자의 표면은 매끈하였다. 마전분의 아밀로오스 함량은 $29{\sim}33%$였고 물결합력은 $109.9{\sim}118.3%$ 였으며 온도변화에 따른 광투과도는 $70{\sim}75^{\circ}C$에서 상승 현상을 나타내는데 특히 참마는 $85^{\circ}C$부근에서 double stage 형태를 나타내었다. 팽윤력과 용해도는 단마가 다소 높은 수치를 나타내었고, 5% 마전분의 아밀로그램에 의하면 $80.3{\sim}84.3^{\circ}C$의 높은 호화 개시온도로 $95^{\circ}C$에서 가열시 계속적인 점도 상승 현상을 나타내었다. 마전분에 glucoamylase를 작용시킨 결과 반응 48시간후 최고 34%의 낮은 분해율을 보인반면 DMSO에 의해서는 반응 48시간 후 최고 100%의 용해율을 나타내었다. 마전분 및 전분에서 분리, 정제한 아밀로오스와 아밀로펙틴의 ${\beta}-amylolysis limit$는 마전분의 경우 $71.8{\sim}75.5%$를 나타내었고 아밀로오스에 있어서는 $90.2{\sim}92.1%$였으며 아밀로펙틴의 경우 $63.7{\sim}66.9%$를 나타내었다. 전분을 Sepharose CL-2B column으로 겔 크로마토그라피한 결과 모두 2개의 peak로 분리되었으며 pullulanase로 마밀로펙틴의 ${\alpha}-1,6-glucosidase$결합을 가수분해시킨 후 Sephadex G-75로 겔 크로마토그라피한 결과 peak II와 peak III의 정점에서의 중합도는 각각 15와 40부근이며 peak II에 대한 peak III의 중량비는 $2.15{\sim}2.42$ 분포를 나타내었다.

• 한국식품과학회지
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• 제26권2호
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• pp.110-116
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• 1994

효소적수식에 따른 정어리 myofibrillar protein의 특성변화를 연구하기 위하여 1/100량의 pepsin으로 $37^{\circ}C$. pH 1.65에서 각각 1, 4, 8, 12, 24시간 부분가수분해시킨 후 단백질의 물리화학적 및 기능적 특성을 검토하였다. 정어리 myofibrillar protein은 pepsin에 의하여 가수분해 1시간까지는 직선적으로 가수분해율이 증가되어 약 30%의 가수분해율을 나타내었고 가수분해 4시간에는 약 40%의 가수분해율을 나타내었으나, 그 이후에는 더 이상 가수분해되지 않아 가수분해 24시간에도 가수분해율은 크게 증가되지 않았다. 전기영동상은 분자량 40,000정도의 굵은 band는 큰 변화를 나타내지 않고 비교적 분자량이 큰 것으로 보이는 상층부의 몇몇 엷은 band와 분자량이 작은 하층부의 band가 가수분해가 진행되면서 소실되었다. 중간부위에 위치하는 몇몇 엷은 band는 가수분해시간이 지나면서 하나로 뭉쳐지는 듯한 경향을 나타내었다. Gel여과 pattern은 두개의 큰 peak와 세개의 작은 peak를 나타내 주고 있는데 가수분해 1시간에 작은 peak는 모두 사라지고 앞쪽의 큰 peak는 가수분해시간이 지남에 따라 점차 작아지고 뒷쪽의 큰 peak는 가수분해시간이 지남에 따라 점차 약간씩 뒤로 밀려가는 경항을 나타내었다. 유화활성과 유화용량은 pepsin 가수분해에 의하여 모두 감소되었으며 특히 유화용량은 가수분해 시간이 경과되면서 현저히 감소되어 가수분해 24시간에는 약 59%로 저하되었다. 유화활성은 가수분해기간중 큰 변화를 나타내지 않아 가수분해 24시간에도 약 94%의 유화활성이 유지되었다. 기포력은 크게 증가되어 가수분해 24시간에는 대조구의 1.9배나 증가되었다. 거품안 정성은 반대로 감소되어 가수분해 8시간에는 약 0.6배로 감소되었으나 그 이후에는 다시 증가되어 가수분해 24시간에는 약 0.8배로 감소율이 둔화되었다. 열응고성은 pepsin수식에 의하여 0.55 내지 0.69배로 감소되었으며 점도는 가수분해시간이 길어지면서 점차 증대되어 가수분해 24시간에는 약 1.36배 증대되었다. 흡수율은 현저히 떨어져 가수분해 1시간에 약 0.32배로 감소되었고 용해도는 현저히 커져 가수분해 1시간에 약 1.46배로 증대되었다. 그러나 그 이후에는 흡수율이나 용해도 모두 더 이상 큰 변화를 나타내지 않았다. 용해도의 pH의존성은, pH 5와 9부근에서 다소 낮은 용해도를 나타내었으며 pepsin수식에 의하여 이러한 경향은 가수분해 초기인 1시간에는 더욱 뚜렸이 나타났다가 가수분해 후기인 24시간에는 크게 둔화되는 양상을 나타내었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제24권2호
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• pp.177-186
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• 1986

폐(肺)디스토마증(症)의 면역혈청학적(免疫血淸學的) 진단(診斷)에 사용(使用)하는 성충항원(成蟲抗原)을 몇가지 생화학적(生化學的) 방법(方法)으로 분획(分劃)하여 정제항원(精製抗原)으로서의 가치(價値)를 검토(檢討)하고자 하였으며, 실험적(實驗的)으로 폐(肺)디스토마 피낭유충(被囊幼蟲)을 감염(感染)시킨 고양이에서 감염강도(感染强度), 감염경과(感染經過) 및 치료(治療)에 따른 ELISA 항체가(抗體價)의 변동(變動)을 추적(追跡)하였다. 폐(肺)디스토마 조항원(粗抗原)은 ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography 및 gel permeation을 거쳐 5개(個)의 분획항원(分劃抗原)으로 나누었으며 폐(肺)디스토마 피낭유충(被囊幼蟲)을 60개(個)(60mc군(群)), 30개(個)(30mc군(群)), 15개(個)(15mc군(群)) 그리고 5개(個)(5mc군(群))씩 각각(各各) 고양이 10마리에 경구투여(經口投與)하고, 5마리씩에는 150일후(日後)에 praziquantel을 100mg/kg로 2회(回) 1일(日) 투여(投與)하였으며 혈청(血淸)은 10일(日) 간격(間隔)으로 채취하였다. 항원(抗原)은 $2{\mu}g/ml$의 농도(濃度)로 사용(使用)하고 실험혈청(實驗血淸)은 100배(倍) 희석(稀釋)하여 ELISA법(法)을 실시(實施)하여 다음의 결과(結果)를 얻었다. 1. Ammonium sulfate precipitation에 의(依)해 분회(分劃)된 항원(抗原)들의 양성혈청(陽性血淸)에 대(對)한 ELISA값은 $51{\sim}55%$ ammonium sulfate 농도(濃度)에서의 침전분획(沈澱分劃)(PA2)이 가장 높았고 다음이 $0{\sim}5%$ 침전분획(沈澱分劃)(PA1), $66{\sim}80%$ 침전분획(沈澱分劃)(PA3)의 순(順)이었으며 $81{\sim}90%$ 침전분획(沈澱分劃)(PA4) 및 침전(沈澱)안된 분획(分劃)(PA5)은 ELISA값이 매우 낮았다. 2. PA1, PA2 및 PA3 분획(分劃)들을 DEAE-cellulose column에 통과(通過)시켜 얻은 분획(分劃)들은 ELISA값에서 유의(有意)한 차이(差異)가 없었다. 3. Sephadex G-200 gel을 통과(通過)한 PA1과 PA2 분획(分劃)들은 분자량(分子量)이 큰 배분(部分)(PA1-I, PA2-I)과 분자량(分子量)이 작은 배분(部分)(PA1-II, PA2-II)에서 높은 ELISA갖을 보였으며 PA3 분획(分劃)은 분자량(分子量)이 큰 배분(部分)(PA3-I)에서만 ELISA값이 높게 나타났다. 4. 전기영동(電氣泳動)의 결과(結果) PA1-I 분획(分劃)은 주(主)로 분자량(分子量) $270K{\sim}196K$ dalton의 단백질(蛋白質)로 되어있고 220K dalton의 단백질(蛋白質)이 가장 많았으며 PA2-I 분획(分劃)은 $255K{\sim}225K$ dalton의 단백질(蛋白質)들로, PA3-I 분획(分劃)은 $235K{\sim}240K$ dalton의 단백질(蛋白質)들로 구성(構成)되어 있었다. 그리고 PA1-II 및 PA2-II 분획(分劃)들은 30K dalton의 단백질(蛋白質)로 이루어져 있었다. 5. 폐(肺)디스토마 감영경과(感染經過)에 따른 ELISA값을 보면 감염후(感染後) $10{\sim}20$일(日) 부터 상승(上昇)하여 $140{\sim}180$일(日)에 최고치(最高値)에 달하며 이후(以後) $0.05{\sim}0.1$정도 하강(下降)한 값으로 계속 유지(維持)되었다. 그리고 폐(肺)디스토마 감염강도(感染强度)에 따른 ELISA값의 차이(差異)는 볼 수 없었다. 6. 고양이에 폐(肺)디스토마를 감염(感染)시킨 150일후(日後)에 praziquantel로 치료(治療)하였을 때 60mc 투여군(投與群)은 치료후(治療後) 150일(日)까지 양성범위(陽性範圍)의 ELISA값을 유지(維持)하였으나 치료전(治療前)에 비(比)하여는 유의(有意)하게 ELISA값이 하강(下降)하였다. 30mc, 15mc 및 5mc 투여군(投與群)의 경우에는 치료후(治療後) $60{\sim}80$일(日)에 ELISA값이 피낭유충(被囊幼蟲) 투여전(投與前)과 비슷한 수준(水準)으로 떨어졌다. 7. 각(各) 항원(抗原)에 따른 ELISA값은 PA1-I 분획항원(分劃抗原)이 가장 높았고 PA2-I 분획항원(分劃抗原)이 다음이었다. PA1-I, PA2-II 및 PA3- I 분획항원(分劃抗原)들은 서로 비슷한 ELISA 값으로 그 다음이었으며 조항원(粗抗原)이 가장 낮은 값을 나타내었다. 특(特)히 PA1-II 분획(分劃)은 감염초기(感染初期)부터 ELISA값이 급격(急激)히 상승(上昇)하여 감염(感染) $20{\sim}30$일후(日後)에는 양성범위(陽性範圍)의 값을 나타내었다. 그리고 Praziquantel로 치료(治療)한 후(後)의 ELISA값은 각(各) 항원(抗原)에 따라 차이(差異)를 볼 수 없었다.